美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液揮發性物質和游離氨基酸的影響

棘懷飛1,,李 曄,*,張迪雅1,,何曉倩1,唐浩博,蘇秀榕

(1.寧波大學食品與藥學學院,浙江寧波 315832;2.寧波大學海洋學院,浙江寧波 315832)

金槍魚也稱鮪魚、吞拿魚,具有低脂肪、高蛋白質、營養豐富等特點。魚肉中多不飽和脂肪酸、蛋氨酸、牛磺酸、礦物質、微量元素和維生素等含量也極為豐富。一直被視為綠色、安全、無污染食品。金槍魚的肌肉由普通肉和紅肉構成,普通肉用于制作罐頭和生魚片,而金槍魚的紅肉因肉質粗糙、腥味重、口感酸澀等問題,多被用于加工成飼料。但研究表明金槍魚紅肉的營養價值并不遜色于普通肉。蘇陽等[1]比較了南海產3種金槍魚普通肉和暗色肉的營養成分,結果發現,暗色肉中的蛋白營養價值略低于普通肉,但總脂肪以及不飽和脂肪酸的含量均高于普通肉,也含有豐富的Ca、Fe、Zn等礦物元素。因此研究如何高值化利用這一蛋白質資源,將具有重要意義。

蛋白酶解技術因其反應條件溫和,水解效率高,被廣泛應用于水產蛋白的綜合加工利用上[2-3]。金槍魚紅肉在一定條件下經蛋白酶水解,可產生具有多種生理活性的多肽分子[4-5]。但水產品酶解液通常腥味較重,鮮味雖濃,卻過于簡單突出,整體風味單薄,并且往往還具有苦味等缺點[6],從而影響了酶解液下游產品的開發。

風味是食品品質的重要組成部分,美拉德反應是形成或改善食品風味的重要途徑之一。在美拉德反應過程中,風味物質的形成不僅與游離氨基酸和多肽自身的熱降解有關,還可與還原糖、脂肪等物質發生一系列復雜的化學反應,生成多種含氮、氧的雜環化合物以及含硫化合物[7-8]。利用美拉德反應改善水產品酶解液的風味,以制備各種海鮮調味料,或高值化開發具保健功能的食品,已取得較大的進展。如鐘機[9]采用生物酶工程技術酶解藍圓鲹魚肉蛋白制備酶解液,并對酶解工藝條件進行優化,在此基礎上對酶解液美拉德反應的生香工藝進行研究,得到風味良好,肉香味濃郁的反應產物。熊何健等[10]采用響應面法進行多元回歸擬合,優化美拉德反應條件,利用HPLC、GC-MS分析并鑒定了羅非魚魚排蛋白酶解液美拉德反應產物的有機酸及揮發性風味成分,探討美拉德反應對羅非魚魚排蛋白酶解液風味的影響。孫麗平等[11]以鯉魚魚鱗酶解液和葡萄糖為底物進行美拉德反應,制備出了風味良好的調味基料。

本研究利用蛋白酶解技術以及美拉德反應,通過GC-MS和HPLC分析,研究了金槍魚紅肉酶解液在美拉德反應過程中揮發性物質以及游離氨基酸的變化情況,探究美拉德反應對酶解液風味的改善作用。以期為金槍魚紅肉酶解液產品的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的金槍魚紅肉 寧波今日食品有限公司;動物蛋白酶(1500 U/g)、堿性蛋白酶(1×105U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;葡萄糖(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;磷酸氫二鈉 阿拉丁試劑(上海)有限公司;乙腈、甲醇 國藥集團化學試劑有限公司;氨基酸混合標準溶液(2.5 μmol/mol) 美國Agilent公司。

Agilent 1200型高效液相色譜、Agilent 7890A型氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司(美國);M7-80EI質譜儀 北京普析通用儀器有限責任公司(中國);65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭 Supelco公司(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚紅肉酶解液的制備 在前期實驗中,通過單因素和響應面優化酶解工藝,得到金槍魚紅肉的最佳酶解條件。本實驗根據該酶解條件獲得金槍魚紅肉酶解液,簡要工藝如下:將金槍魚紅肉去骨刺,放入攪碎機中攪碎至肉泥。取40 g紅肉泥,按照1∶4 (V/V)的料液比加水160 mL,加入占紅肉泥質量分數為2%的復合蛋白酶(動物蛋白酶∶堿性蛋白酶為2∶1),55 ℃條件下酶解6 h。酶解后在100 ℃水浴鍋中滅酶10 min,8000 r/min常溫離心10 min去除沉淀,上清液即為金槍魚紅肉酶解液。

1.2.2 酶解液的美拉德反應 取5 mL酶解液置于15 mL固相微萃取(SPME)頂空瓶中,共分為四組,每組添加質量分數2%的葡萄糖,100 ℃條件下進行美拉德反應。實驗組加熱時間分別為30、60和90 min。未加熱的作為對照組。每組樣品設3個平行。用于揮發性風味物質的檢測。

同時,取5 mL酶解液置于15 mL普通樣品瓶中,按上述操作同樣進行美拉德反應。用于游離氨基酸的檢測。

1.2.3 GC-MS測定 取1.2.2制備的測揮發性物質的各組樣品于SPME頂空瓶中,旋緊瓶蓋,密封靜置30 min。將萃取頭(65 μm聚二甲基硅氧烷,PDMS)置于氣相色譜的進樣口,在250 ℃的條件下老化45 min[8]。處理后的萃取頭插入頂空瓶1 cm處,于60 ℃水浴30 min以萃取樣品中的揮發性物質。萃取結束后,將萃取頭快速插入GC-MS進樣口,于220 ℃解吸附2 min,之后進行GC-MS分析。

GC條件:選用毛細管柱VOCOL(60 m×0.32 mm×1.8 μm);升溫程序為:起始柱溫為35 ℃保持2 min,然后以3 ℃/min升溫至40 ℃,并保持1 min,再以5 ℃/min升溫至210 ℃,保持20 min。載氣為He,流速1.0 mL/min;采用不分流模式進樣;進樣口和接口溫度均為210 ℃;

MS條件:離子源:電子轟擊源(EI);離子源溫度:200 ℃;質量掃描范圍:45～500 amu。

1.2.4 游離氨基酸的HPLC測定 衍生化處理:取1.2.2制備的檢測游離氨基酸的樣品,首先用鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)進行自動在線衍生化處理。自動衍生化程序參照安捷倫公司提供的操作手冊[12]。同時將0.1 mol·L-1鹽酸溶液與氨基酸混合標準溶液混合,分別稀釋至10、100、250、500和1000 pmol·μL-1,按同樣方法進行衍生化處理。

HPLC條件:色譜柱為Zorbax Eclipse AAA柱(4.6 mm×150 mm);流動相A 液:40 mmol/L 磷酸氫二鈉溶液(pH=7.8),流動相B液:乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10,V/V/V);流速:2 mL/min;梯度洗脫(V/V)程序:0～1.9 min,100% A;1.9～18.1 min,100% A→43% A,57% B;18.1～18.6 min,43% A,57% B →100% B;18.6～22.3 min,100% B;22.3～23.2 min,100% B →100% A;23.2～26.0 min,100% A;檢測:二極管陣列檢測器(DAD),檢測波長UV 338 nm,進樣量10 μL。

1.3 數據分析

表1 美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液揮發性物質的影響(%)Table 1 The effect of Maillard reaction on volatile compounds in hydrolysate of tuna red meat(%)

GC-MS數據通過NIST和WILEY譜庫對測得的揮發性成分進行計算機檢索,定性確定化合物,采用峰面積歸一化法確定各組分相對百分含量。HPLC數據根據氨基酸峰面積和標準氨基酸溶液的濃度(pmol·μL-1)繪制標準曲線,樣品采用峰面積外標法進行定量測定。數據用SPSS 19.0 軟件進行分析,結果以x±s表示。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應時間對金槍魚紅肉酶解液揮發性物質的影響

美拉德反應時間對金槍魚紅肉酶解液中的揮發性物質的組成和含量的影響見表1和圖1。本實驗中共檢測到19中揮發性化合物,包括醛類、酯類、呋喃類、烷烴類、芳香烴類以及醇類和酮類。其中對照組10種,不同加熱時間(30、60和90 min)的反應組分別檢測出12種、15種和15種。其中共有成分有8種,分別是己醛、壬醛、3-乙基-苯甲醛、丁酸甲酯、2-戊基呋喃、順式-2-(2-戊烯基)呋喃、1,5-二乙烯基-3-甲基-2-亞甲基-(1α,3α,5α)-環己烷和2,4-二叔丁基苯酚。

圖1 美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液中揮發性物質含量和組成的影響Fig.1 The effect of Maillard reaction on volatile substances contents in hydrolysate of tuna red meat

2.1.1 醛類化合物 醛類物質主要來源于脂肪的降解和氧化,本實驗中共檢測出5種醛類物質(表1)。醛類化合物具有脂肪香味,盡管相對含量較低,但其閾值通常比其他化合物低,因此往往是評價食物,尤其是肉類風味的可靠指標[13-14]。對照組醛類的總含量最高,含有4種醛類化合物,包括己醛、辛醛、壬醛和3-乙基-苯甲醛;反應組中也含有4種醛類化合物,包括己醛、苯甲醛、壬醛和3-乙基-苯甲醛。其中辛醛僅存在于對照組中,而苯甲醛僅存在于反應組中。醛類物質是油脂類物質中ω-6不飽和脂肪酸的主要氧化產物,對肉類整體風味的形成具有重要作用。其中壬醛在醛類中相對含量最高,其具有強烈的油脂氣味,魚腥味以及柑橘樣風味,隨著美拉德反應時間增加,壬醛相對含量呈下降趨勢。己醛通常產生一種原生味、鮮香和類醛的特征香味[15],具有青草味-脂肪味。反應組中隨著加熱時間的延長,醛類的總含量逐漸下降。說明醛類物質在美拉德反應過程中產生了其他物質,如類黑素物質、雜環小分子物質等。

2.1.2 酯類化合物 短鏈酯類化合物能夠賦予食品香甜的水果香味[16-17]。本次實驗測得的脂類化合物只有丁酸甲酯,其含量很高,在對照組中為52.27%,加熱30、60和90 min的酶解液中分別為34.83%、22.62%和21.04%(表1)。

表2 美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液中游離氨基酸含量的影響(mg/100 mL)Table 2 The effect of Maillard reaction on the concentration of free amino acids in hydrolysate of tuna red meat(mg/100 mL)

結果表明,加熱反應之后,丁酸甲酯的相對含量不斷降低,推測美拉德反應過程中丁酸甲酯可能發生了降解,也可能反應生成了其他雜環小分子物質。

2.1.3 呋喃類化合物 呋喃類化合物來源于氨基酸與還原糖間的美拉德反應以及氨基酸的熱分解反應,它們大都具有很強的肉香味以及極低的香氣閾值,如2-乙基呋喃有強烈的肉香味和甜味,2-戊基呋喃具有類似火腿香味,產生誘人的芳香味[18-19]。本實驗結果表明(表1和圖1),對照組中呋喃類相對含量較小,經過美拉德反應后,樣品中呋喃類化合物相對含量上升趨勢較明顯。說明美拉德反應促進了呋喃類化合物的合成,而呋喃類化合物對金槍魚紅肉酶解液具有重要的增香作用。

2.1.4 烷烴類以及芳香類化合物 由表1和圖1可知,與對照組相比,反應組中烷烴類物質含量顯著增加。對照組中的含量為12.12%,加熱不同時間后,各組的含量分別為33.34%、41.71%和42.34%。表明隨著加熱時間延長,烷烴類物質被不斷生成。但盡管含量較高,烷烴類物質的閾值也普遍較高,所以它們對風味的形成影響不大。

同時酶解液中還鑒定出一些芳香類化合物,如2,4-二叔丁基苯酚,甲氧基苯基肟等。它們含量較少,但由于閾值較低,對風味形成具有重要的作用。

2.2 游離氨基酸種類及含量分析

根據氨基酸標準曲線計算各樣品中游離氨基酸的含量,并統計總游離氨基酸(Total Free Amino Acids,TFAA)及呈味氨基酸(Delicious Amino Acids,DAA)[20]的含量(表2)。

游離氨基酸既是重要的滋味物質,也是香味前體物質,參與美拉德反應和含硫化合物降解,從而影響金槍魚紅肉酶解液的整體風味。美拉德反應(Maillard reaction)是一種非酶褐變反應,本質上是羰氨縮合,主要指的是醛、酮、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質等含氮化合物的氨基之間發生反應,進而生成種類繁多的反應產物,這些產物可賦予食品獨特的色澤和風味[21]。而反應體系中游離氨基酸的含量主要取決于Strecker降解、氨基酸與糖的交聯以及肽的降解反應[22]。由表2可知,酶解液經美拉德反應后,與對照組相比,總游離氨基酸(TFAA)含量顯著增加。且隨著加熱時間的延長,含量繼續增加,表明金槍魚紅肉酶解液在加熱過程中依然以肽的降解為主。

此外,游離氨基酸的呈味與其側鏈R基團的疏水性密切相關,當氨基酸的疏水性較小時,主要呈甜味,如丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和脯氨酸;疏水性較大時,主要呈苦味,如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸,還包括賴氨酸、精氨酸、酪氨酸和組氨酸。此外,谷氨酸和天冬氨酸是形成鮮味的重要物質基礎[23]。上述氨基酸被統稱為呈味氨基酸。紅肉酶解液隨加熱時間的延長,呈味氨基酸含量顯著增加。表明加熱使酶解液呈味更加豐富,同時也為美拉德反應的繼續進行提供底物。

表3 金槍魚紅肉酶解液游離氨基酸的呈味特性Table 3 The taste activity values of free amino acids in hydrolysate of tuna red meat

進一步統計鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸在不同酶解液占總DAA比例的變化,結果見圖2。鮮味氨基酸占DAA的比例隨著加熱時間的延長先減少后增加,由對照組中的9.37%下降到60 min時的最低值6.22%;甜味氨基酸的變化情況與鮮味氨基酸類似,由對照組的10.05%下降到60 min時的最低值6.57%;苦味氨基酸則相反,隨著加熱時間的延長,比例先增加后減少,但最終含量比對照組高。上述結果表明,雖然美拉德反應促使體系中游離氨基酸和呈味氨基酸總體含量增加,但卻更多地向苦味方向發展,因此如何脫苦是下一步需要解決的重要問題。

圖2 美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液中呈味氨基酸含量的影響Fig.2 The effect of Maillard reaction on the concentration of delicious amino acids in hydrolysate of tuna red meat

2.3 金槍魚紅肉酶解液呈味特性及TAV分析

TAV[24]表示各個呈味物質的含量與其閾值的比。通常認為,當TAV大于1時,該物質對樣品的呈味有貢獻,且值越大貢獻越大,當TAV小于1時,該物質對樣品的呈味沒有貢獻。由此可以確定一個體系中的主要呈味氨基酸以及它們對滋味的貢獻。表3對不同組別的呈味氨基酸的TAV進行了比較。谷氨酸是重要的鮮味劑,在對照組和美拉德反應組中,谷氨酸的TAV值均較高,并且在加熱90 min時達到最大值。表明金槍魚紅肉酶解后鮮味突出,且在美拉德反應過程中被進一步突出。在甜味氨基酸中,甘氨酸和丙氨酸的TAV值最大,所以這兩類氨基酸對紅肉酶解液甜味的貢獻最大。但是從對照組總體上來看,甜味氨基酸的TAV值遠低于鮮味和苦味,說明甜味在紅肉酶解液的滋味中體現較少。苦味氨基酸中TAV值最高的氨基酸是精氨酸,其次是異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸,這些氨基酸不但對苦味的形成具有重要貢獻,同時還有增加呈味復雜性和相對提高鮮度的作用[25]。此外,甲硫氨酸也具有較高的TAV值,并在加熱過程中有較大的提高。而甲硫氨酸這類含硫氨基酸被認為對肉風味的形成,尤其是熟肉香味的形成具有重要貢獻[26]。

3 結論

本實驗通過GC-MS和HPLC研究美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液中揮發性物質和游離氨基酸的影響。結果發現,美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液的揮發性物質和游離氨基酸的組成及含量均有不同程度的影響。隨著反應時間的延長,酯類和芳香烴類物質減少明顯,而呋喃類和烷烴類物質增加明顯;呈味氨基酸的含量隨美拉德反應不斷上升,但鮮味和甜味氨基酸的比例均隨著反應時間的增加而減少,而苦味氨基酸的比例增加明顯。表明本實驗中的美拉德反應一方面使金槍魚紅肉酶解液產生獨特的風味物質,另一方面還促進了酶解液中脂類物質的進一步氧化和多肽的進一步水解。從而更加豐富了金槍魚酶解液的風味,但是由于苦味氨基酸的含量增加,如何脫苦是下一步需要解決的問題！