繡球菌低分子量多糖的制備工藝優(yōu)化及其分子量的測(cè)定

陳洋煒,鄭莛予,高云杉,鄭明鋒

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

繡球菌(Sparassiscrispa)屬擔(dān)子菌亞門、異隔擔(dān)子菌綱、無(wú)褶菌目、繡球菌科[1]。在中國(guó),繡球菌是一種名貴的食用菌,主要分布在東北、云南等林區(qū)中。研究發(fā)現(xiàn),繡球菌多糖是一種β-葡聚糖,其含量占繡球菌子實(shí)體干重的43%[2]。β-葡聚糖廣泛的存在于真菌的細(xì)胞壁中,約占細(xì)胞壁質(zhì)量的一半,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有較強(qiáng)的生物活性[3]。多糖分子質(zhì)量大小和分子質(zhì)量分布是決定其物理特性和生理活性的重要因素之一[4]。不同分子量的多糖,在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異,導(dǎo)致其有與原多糖功能特性不同[5],但由于多糖的分子量較大,不利于研究其結(jié)構(gòu)特性,以至于其活性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系無(wú)法說(shuō)明。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ń到舛嗵?可降低多糖粘度,增強(qiáng)水溶性,有利于細(xì)胞等生物體的吸收,而且有研究表明低分子量的多糖具有更好的生物活性。Ishimoto等[6]對(duì)酵母β-葡聚糖進(jìn)行45%硫酸降解,發(fā)現(xiàn)分子量更小的葡聚糖表現(xiàn)出對(duì)dectin-1更好的結(jié)合效果,且其對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧和細(xì)胞因子表現(xiàn)出拮抗活性。吳婷等[7]通過(guò)酸解葫蘆巴中性多糖,表明經(jīng)酸解后形成的產(chǎn)物明顯促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長(zhǎng),抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

多糖降解一般都采用苯酚-硫酸法[8]、DNS法[9]或者對(duì)·OH清除率[10]等抗氧化性為降解程度指標(biāo),但是多糖是否得到降解和其降解程度不得而知,MALLS技術(shù)是一種測(cè)定聚合物分子量一種非常有效的工具,MALLS法測(cè)定分子量原理[11]是激光照射到樣品時(shí),會(huì)在各個(gè)方向產(chǎn)生散射光,在任何方向的光散射強(qiáng)度與相對(duì)分子質(zhì)量和溶液的濃度成正比,適合于混合物及蛋白質(zhì)等生物大分子的測(cè)定,不需要對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,具有靈敏、快速,對(duì)雜質(zhì)的包容性強(qiáng),分析質(zhì)量范圍大的特點(diǎn)[12]。

因此,本試驗(yàn)采用硫酸降解繡球菌多糖,在考察硫酸濃度、酸解溫度、反應(yīng)時(shí)間和料液比積等4個(gè)單因素對(duì)多糖水解度影響的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)酸解工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)酸解前后繡球菌多糖進(jìn)行多角度激光光散射儀測(cè)定,旨在研究酸解制備繡球菌低分子量多糖的優(yōu)化工藝,結(jié)合DNS法和多角度激光散射儀共同驗(yàn)證繡球菌多糖的酸解程度,為繡球菌低分子量多糖進(jìn)一步的分離純化、結(jié)構(gòu)表征和功能活性開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繡球菌干品 福清市火麒麟食用菌技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;濃硫酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鋇、氯化鈉等 分析純,均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)中所用的水均為去離子水。

DE-1000 g粉碎機(jī) 紅景天公司;SK8210LHC超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;XD-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器公司;LXJ-ⅡB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SB-G、SB-806 HQ、SB-804 HQ體積排阻色譜柱、RI-101示差折光檢測(cè)器 Shodex公司;DAWN HWLEOSⅡ動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng) Wyatt公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 繡球菌多糖制備 繡球菌多糖的制備參照崔麗霞等[13]的方法,稍作修改,具體方法如下:

繡球菌→清洗→破碎勻漿→100 ℃熱水浸提6 h→冷卻至室溫→5000 r/min離心15 min→繡球菌粗多糖溶液→旋轉(zhuǎn)濃縮至原1/3體積(65 ℃、0.095 MPa)→4 ℃醇沉12 h→2倍質(zhì)量純水復(fù)溶→真空冷凍干燥24 h(0.10 mbar,-75 ℃)→繡球菌多糖干粉。

1.2.2 還原糖含量測(cè)定 還原糖含量測(cè)定采用 DNS法[14]。DNS配方為每100 mL水加18.2 g酒石酸鉀鈉、0.63 g 3,5-二硝基水楊酸、2.1 g氫氧化鈉、0.5 g苯酚,溶液配制后,穩(wěn)定一周后使用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:葡萄糖105 ℃干燥至恒重,準(zhǔn)確稱取并配成濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,不足1.0 mL用去離子水補(bǔ)齊。加入1.50 mL DNS溶液,沸水浴5 min。反應(yīng)結(jié)束,流水冷卻,補(bǔ)水至25.0 mL。在540 nm波長(zhǎng)下,以0號(hào)管為空白,測(cè)定吸光值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程:y=0.5724x-0.0118,R2=0.9993。

1.2.3 繡球菌多糖酸解 取一定量的繡球菌多糖粉末,按一定的料液比加入一定濃度的的稀硫酸,空白組加入等量蒸餾水,在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間,反應(yīng)期間定時(shí)振蕩混勻。反應(yīng)結(jié)束后,流水冷卻2 min,再加入適量0.5 mol/L NaOH,使溶液pH=7,定容至25 mL容量瓶中,混勻。用上述DNS法,以空白組為對(duì)照,540 nm測(cè)定吸光值。將水解物中還原糖含量占多糖質(zhì)量的比值定義為繡球菌多糖酸解的水解度[15],即:

水解度(%)=還原糖含量mg/多糖質(zhì)量mg×100

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 硫酸濃度對(duì)水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,在溫度95 ℃、反應(yīng)時(shí)間150 min、液料比5∶1 mL/g的條件下,研究硫酸濃度分別為0.092、0.280、0.460、0.640、0.830 mol/L對(duì)繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.2 溫度對(duì)水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、反應(yīng)時(shí)間150 min、液料比5∶1 mL/g條件下,研究溫度分別為80、85、90、95、100 ℃對(duì)繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、溫度95 ℃、液料比5∶1 mL/g的條件下,研究時(shí)間分別為60、90、120、150、180 min對(duì)繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.4 液料比對(duì)水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、溫度95 ℃、反應(yīng)時(shí)間150 min的條件下,研究液料比分別為2.5∶1、5.0∶1、7.5∶1、10.0∶1、12.5∶1 mL/g對(duì)繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化酸解工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以硫酸濃度A、反應(yīng)時(shí)間B、料液比C為自變量,多糖水解度(%)為因變量,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面法分析試驗(yàn),確定繡球菌多糖水解的最佳工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 分子量測(cè)定 分子量的測(cè)定參照Chen等[16]的方法,并做略微修改。試驗(yàn)采用SEC-MALLS-RI體系對(duì)繡球菌多糖酸解前后分子量進(jìn)行檢測(cè),該系統(tǒng)主要包括凝膠滲透色譜柱(SEC)、多角度激光光散射檢測(cè)器(MALLS)和示差折光檢測(cè)器(RI)[17],采用SB-806 M HQ和SB-804 M HQ 兩根柱子串聯(lián),上樣多糖濃度為0.2 mg/mL,進(jìn)樣量為1 mL,流動(dòng)相為0.1 mol/L NaCl溶液,流速0.3 mL/min,柱溫箱溫度25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析;采用Design-Expert 8.0.6對(duì)酸解數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,并對(duì)模型做顯著性分析;采用ASTRA 6.1軟件對(duì)分子量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖1 單因素對(duì)繡球菌多糖(SCG)水解度的影響Fig.1 Effect of single factor on the degree of hydrolysis of SCG注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2a可知,硫酸濃度對(duì)繡球菌多糖水解度的影響隨著硫酸濃度增大而增大,在硫酸濃度為0.46 mol/L時(shí),繡球菌多糖水解度最高為59.10%,之后隨著硫酸濃度升高,水解度降低。可能是因?yàn)楦邼舛人嵩诟邷叵聲?huì)使多糖完全水解成單糖[18],且在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在硫酸濃度過(guò)高時(shí),會(huì)出現(xiàn)多糖碳化、溶液變黑等現(xiàn)象。因此,選硫酸濃度為0.46 mol/L為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

由圖2b可知,繡球菌多糖水解度隨著溫度升高而增加,這可能是因?yàn)楦邷匾餒+的劇烈運(yùn)動(dòng),與多糖的糖苷鍵接觸機(jī)會(huì)增加,加快糖苷鍵斷裂[19]。可從圖中曲線看到,在95～100 ℃時(shí)繡球菌多糖的水解度沒(méi)有顯著影響,考慮溫度因素對(duì)繡球菌多糖水解的影響,結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際條件,將繡球菌多糖水解的溫度設(shè)為95 ℃。

由圖2c可知,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于90 min時(shí),反應(yīng)不充分,水解度較低。水解度隨著時(shí)間增加而增大,在90 min處于最大值61.02%,并在90～150 min處于穩(wěn)定,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于150 min時(shí),多糖水解的部分可能在酸催化下繼續(xù)水解成單糖[20],水解度隨著時(shí)間增加而減小。故選擇反應(yīng)時(shí)間90 min為中心點(diǎn)。

由圖2d可知,當(dāng)液料比為5∶1 mL/g時(shí),繡球菌多糖與硫酸充分接觸,水解度最高,為59.58%,當(dāng)液料比大于5∶1 mL/g時(shí),隨著料液比增加,水解度減小,所以選擇5∶1 mL/g作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)繡球菌多糖酸解工藝進(jìn)行優(yōu)化,共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中5個(gè)為零點(diǎn)以估計(jì)誤差,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis variance of regression model

表2 響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Combination design and results of response surface

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,擬合出的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=66.37-0.055A-0.69B+0.66C+0.23AB+1.40AC+0.69BC-6.74A2-6.33B2-5.54C2。本試驗(yàn)的二項(xiàng)式回歸模擬系數(shù)的顯著性分析見(jiàn)表3。該模型的擬合程度達(dá)到極顯著水平(P<0.0001),且該模型失擬項(xiàng)不顯著P>0.05,說(shuō)明殘差由隨機(jī)誤差引起。模型決定系數(shù)R2=0.9846>0.9,說(shuō)明可以用回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。從表3可以看出,B、C為顯著(P<0.05),A不顯著;交互項(xiàng)AC為極顯著(P<0.01),AB、BC不顯著,二次項(xiàng)A2、B2、C2均為極顯著(P<0.05)。比較F值大小可以看出影響繡球菌多糖水解度的因素順序?yàn)?反應(yīng)時(shí)間(B)>料液比(C)>硫酸濃度(A)。

圖2 硫酸濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖水解度的影響Fig.2 Effect of sulfuric acid concentration and reaction time on degree of hydrolysis of polysaccharides

2.2.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)Design-expert.V8.0.6軟件設(shè)計(jì)三維響應(yīng)面來(lái)反映最佳區(qū)域,分別固定回歸模型中任一因素處于0水平,代入模型方程考察其余兩個(gè)因素間的相互作用,從中選取得率最佳的提取條件。由圖2～圖4可知,三組三維圖的彎曲度都比較大,說(shuō)明隨著硫酸濃度、反應(yīng)時(shí)間和液料比等因素水平的變化,繡球菌多糖(SCP)水解度也出現(xiàn)顯著性的先升高再逐漸減小的變化,由表3可知對(duì)反應(yīng)時(shí)間和料液比對(duì)繡球菌多糖水解度影響顯著(P<0.05),但兩個(gè)因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值沒(méi)有顯著的影響(P>0.05)。但硫酸濃度與液料比對(duì)多糖水解度的交互影響極顯著,等高線呈橢圓形,三維曲面圖呈拋物線形。

圖3 硫酸濃度和液料比對(duì)多糖水解度的影響Fig.3 Effect of sulfuric acid concentration and liquid-to-material ratio on hydrolysis degree of polysaccharide

圖4 反應(yīng)時(shí)間與液料比對(duì)多糖水解度的影響Fig.4 Effect of reaction time and liquid-to-material ratio on hydrolysis degree of polysaccharide

2.2.4 最佳結(jié)果驗(yàn)證 根據(jù)Design-Expert所得的最佳工藝參數(shù)條件為:硫酸濃度為0.46 mol/L、反應(yīng)時(shí)間85.5 min、液料比6∶1 mL/g,在此條件下,預(yù)測(cè)多糖水解度為66.40%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體操作情況,將酸解反應(yīng)時(shí)間定為85 min,其余條件不變,重復(fù)三次,最后實(shí)際多糖水解度為67.07%±0.77%,與模型預(yù)測(cè)值的66.40%基本相等,因此該模型預(yù)測(cè)基本準(zhǔn)確,與實(shí)際值擬合良好。

2.3 分子量測(cè)定結(jié)果

SEC-MALLS-RI技術(shù)是通過(guò)MALLS和RI這兩種檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定,通過(guò)計(jì)算可以直接得到樣品中每個(gè)點(diǎn)的絕對(duì)分子量及其組分分布,檢測(cè)前已用葡聚糖標(biāo)品對(duì)儀器進(jìn)行校正。繡球菌多糖在酸解前后分子量,如圖5所示,繡球菌多糖含有三個(gè)組分,與張傳能[21]的研究結(jié)果一致，采用DEAE-52纖維素柱分離繡球菌多糖,發(fā)現(xiàn)其主要有三種組分。酸解后的繡球菌多糖含有兩個(gè)組分。

表4 繡球菌多糖酸解前后分子量分布Table 4 Molecular characterization of SCP and SCLP by SEC-MALLS-RI

圖5 繡球菌多糖(A)及其酸解后(B)SEC-MALLS-RI分析Fig.5 SEC-MALLS-RI analysis of SCP(A)and SCLP(B)

通過(guò)ASTRA 6.1軟件對(duì)結(jié)果處理,其對(duì)應(yīng)的分子量如表4所示,由表4可知繡球菌多糖三個(gè)組分的數(shù)均分子量分別為2.26×107、1.68×106、2.63×106Da,重均分子量分別為3.32×107、1.79×106、3.18×106Da,z均分子量為:5.47×107、1.94×106、4.45×106Da,三種組分的多分散系數(shù)分別為1.47、1.07、1.20,說(shuō)明這三種組分具有良好的均一性;酸解后的繡球菌低分子量多糖含兩個(gè)組分,數(shù)均分子量分別為2.31×105、4.38×105Da,重均分子量分別為3.25×105、5.61×105Da,z均分子量為:5.26×105、8.36×105Da,多分散系數(shù)分別為1.40、1.28,酸解后的組分也體現(xiàn)出良好的均一性。繡球菌多糖在硫酸酸解后,分子量明顯降低,其數(shù)量級(jí)從107和106降到了105,說(shuō)明經(jīng)過(guò)酸解后得到一種低分子量繡球菌多糖。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)以水解度為指標(biāo)研究硫酸對(duì)繡球菌多糖降解的影響,通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化酸解工藝,得到最佳工藝條件為:溫度為95 ℃、硫酸濃度為0.46 mol/L、反應(yīng)時(shí)間85 min、液料比6∶1 mL/g,該條件下多糖水解度為67.07%±0.77%。進(jìn)一步采用SEC-MALLS-RI系統(tǒng)對(duì)繡球菌多糖降解程度進(jìn)行探究,結(jié)果表明,繡球菌多糖在酸解后分子量數(shù)量級(jí)從107到了105說(shuō)明繡球菌多糖得到了有效的水解,且該酸解工藝得到一種低分子量繡球菌多糖;繡球菌多糖在酸解后從3個(gè)組分變成2個(gè)組分,重均分子量分別為3.25×105、5.61×105Da,具有良好的均一性,為后續(xù)的繡球菌低分子量多糖分離純化和分子量-生物活性關(guān)系的研究提供了理論基礎(chǔ)。