酸棗果醋中微生物多樣性的研究

曹 萌 牛偉濤 王僧虎 王寶霞 申晨靜

（1邢臺學院生物科學與工程學院 河北 邢臺 054001；2河北省邢棗仁利用技術創新中心 河北 邢臺 054001）

酸棗，鼠李科棗屬植物，抗寒，耐旱，耐瘠薄，適應性強，在我國中部和南部的省份都有分布，北方較常見[1]。它的果肉營養價值很高，酸棗仁能夠用作中藥材。邢臺處于河北省南部，緊靠太行山，地理環境適合酸棗生長，生產的酸棗質量優，口味好，是全國最大的酸棗產業基地，邢臺縣酸棗種植面積及產量又是邢臺地區之最，被傳頌為“邢臺的酸棗映河北，河北的酸棗映天下”[2]。

近幾年，酸棗主要用于藥用酸棗仁原料，酸棗果肉利用率很低。酸棗果肉內含豐富的營養物質，如多種糖類、礦質元素、維生素和酸類物質等。酸棗果醋是一種新興的酸棗果肉深加工品，它同時具有酸棗和食醋的營養和保健功能，含有10種以上對人體有益的氨基酸和有機酸，發展潛力無限。在酸棗果醋的生產工藝中，發酵微生物能夠直接影響果醋的品質和風味。劉陽[3]等從柑橘果醋生產原料中篩出酵母菌，并發現它們能豐富果醋風味。彭倩[3]等研究了醋中細菌產生的纖維素，證明了細菌對醋的發酵有積極作用，郭冬琴[4]等在橙汁中分離篩選出多種酵母菌，為解決由酵母污染引起的橙汁酸化給予了有效建議。

目前，邢臺在酸棗果醋方面的研究較少，關于果醋中微生物的多樣性也鮮有報道。本文利用現代分子生物學技術，對酸棗果醋中的微生物種類進行測定，為從發酵方面改造酸棗果醋風味及營養成分提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料。邢臺久和農業科技開發有限公司野生酸棗醋。

1.2 儀器與藥品。恒溫培養箱，滅菌鍋，顯微鏡，PCR儀，制冰機，試管，培養皿，接種針；異戊醇，無水乙醇，牛肉膏蛋白胨培養基，YPD培養基，DNA擴增藥品等。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物的分離。處理樣品，吸取100μl酸棗果醋和900μl無菌水于無菌EP管中，制成10個濃度梯度，接著從10-1濃度梯度中用EP管吸取100μl溶液與900μl無菌水，于試管中制成10-2濃度梯度。取300μl水樣于牛肉膏蛋白胨培養基平板和YPD培養基中，用涂布器涂抹均勻，并用封口膜封好。在28℃環境中培養24～48h。

1.3.2 分離菌株的純培養。培養后觀察菌落，將形態不同的菌落挑出，分離出單菌落。并擴大培養，為下一步PCR擴增提供足夠多的菌株。

1.3.3 DNA的提取。細菌DNA的提取方法參照彭倩[3]等的試驗方法，酵母菌DNA提取的詳細步驟參照郭冬琴[5]的試驗方法。

1.3.4 PCR擴增。分為細菌基因擴增與酵母菌基因擴增。①細菌基因擴增：細菌的16SrRNA基因擴增的引物為通用引物27F和1492R，序列和擴增體系見表1；②酵母菌基因擴增：序列和PCR擴增體系見表2。

表1 細菌16SrRNA基因擴增序列及擴增體系

表2 酵母菌基因擴增序列及擴增體系

1.3.5 PCR產物純化。制得1%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/ml)，分別取5μlPCR產物與1μl上樣緩沖液混勻后上樣，用50×TAE電泳緩沖液，電壓60V，電泳40～50min。

1.3.6 PCR產物測序與分析。檢測完成后將合格的產物樣品寄送華大基因有限公司(山東青島市黃島區衡云山路2號國家海洋基因庫)進行16srDNA測序。并將所測的16SrRNA基因序列與EzBioCloud/NCBI/Blast數據庫中序列進行比較，確定其種屬。

2 結果與分析

2.1 分離菌株。經過24～48h培養，觀察原液、稀釋10倍、稀釋100倍的樣品，稀釋10倍的培養基中有較多菌落生長。

2.1.1 牛肉膏蛋白胨培養基中篩選的菌株。從牛肉膏蛋白胨培養基的菌落中，篩選出5種細菌(見圖1，從左到右依次標記為1號菌株、2號菌株、3號菌株、4號菌株、5號菌株)，形態特點記錄見表3。

圖1 牛肉膏蛋白胨培養基中篩選的5種菌株

表3 牛肉膏蛋白胨培養基上篩選的5種菌株

2.1.2 YPD培養基菌落中篩選出的菌株。在YPD培養基的菌落中篩選出5種菌株，見圖2(從左到右依次標記為Y1號菌株、Y2號菌株、Y3號菌株、Y4號菌株、Y5號菌株)，形態特征記錄見表4。

圖2 YPD培養基中篩選的5種菌株

表4 YPD培養基中篩選的5種菌株

2.2 PCR的提純結果。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，1～5號菌株的DNA條帶都在1.5～1.6kb，無雜帶，Y1～Y4號菌株條帶在1.5kb，Y5號菌株有雜帶。可能是DNA提取出現問題造成DNA不純，棄用。電泳圖見圖3、圖4。

圖3 菌株1～5電泳圖

圖4 菌株Y1～Y5電泳圖

2.3 測序結果與分析。對菌株1～5、菌株Y1～Y4，9種菌株進行DNA測序，并將所測的基因序列在EzBioCloud/NCBI/Blast數據庫中進行序列比較，確定其種屬[6]。結果見表5和表6。根據基因數據庫的比對，同時結合菌落的形態特征，經綜合分析得出，邢臺久和農業科技開發有限公司野生酸棗果醋含有以下微生物：菌株1，醋酸桿菌(AcetobacteriumBalch)，屬于醋酸桿菌屬；菌株2，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，屬于芽孢桿菌屬；菌株3，嗜酸菌(Acidophilus)，屬于乳酸桿菌屬；菌株4，雙歧桿菌(Bifidobacterium)，雙歧桿菌屬；菌株5，葡糖醋桿菌(Ga.Azotocaptans)，是葡糖醋桿菌屬；Y1，畢赤酵母(Pichiapastoris)，是畢赤酵母屬；Y2，蜜二糖假絲酵母(Candida melibiosica)，是假絲酵母屬；Y3，釀酒酵母，(Saccharomycescerevisiae)，酵母屬；Y4，確定是酵母菌屬，具體種類有待研究。

表5 1～5號菌株序列比對結果

3 結論與討論

酸棗果醋中主要的微生物有細菌和酵母菌，其中細菌包括醋酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌。醋酸菌的作用是將葡萄糖轉化為酒精，再將酒精氧化為乙酸，同時還能產生其他酸類物質，營造酸性環境。芽孢桿菌能夠產生蛋白酶，水解蛋白質產生氨基酸，豐富果醋的風味，增加色澤。乳酸菌通過自身代謝活動能夠產生大量的乳酸，乳酸能夠降低果醋刺激的酸味，改善果醋的口感。酵母菌利用果醋中的葡萄糖生成乙醇，為醋酸發酵階段提供更多的乙醇，其次，酵母菌還能產生濃郁香氣的風味物質。酸棗果醋的質量和口味受多種微生物的影響，本試驗主要探討了細菌和酵母菌，但查閱文獻可知，也存在小部分霉菌和其他微生物，霉菌的主要作用是降解生物大分子物質等，霉菌和其他微生物的作用和種類有待進一步研究。