美洲南瓜種皮發育相關物質含量變化研究

李文亮 王有德 陳揚 馬仁輝 王夢霞 李發康 徐秉良 薛應鈺

摘要：以美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28為試材，研究了種皮發育過程中種皮鮮重、種皮干重、可溶性糖、淀粉、纖維素、半纖維素和酚類物質的變化規律，結果表明：種皮鮮重，從授粉至種子成熟有殼美洲南瓜高于無殼美洲南瓜，且均逐漸增加;種皮干重，有殼美洲南瓜隨種子成熟逐漸增加，無殼美洲南瓜種皮干重隨種子成熟逐漸減少，但從授粉開始至授粉20 d有殼美洲南瓜的種皮干重低于無殼美洲南瓜;可溶性糖，有殼美洲南瓜呈低-高-低趨勢，無殼美洲南瓜呈逐漸降低趨勢，且總體上有殼美洲南瓜高于無殼美洲南瓜;淀粉含量波動較大，總體基本呈降低趨勢，而且無殼美洲南瓜低于有殼美洲南瓜;纖維素含量無殼美洲南瓜低于有殼美洲南瓜，從授粉開始至授粉20 d均呈降低趨勢，但授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜逐漸增加，而無殼美洲南瓜則逐漸降低;半纖維素和酚類物質的變化趨勢相似，即有殼美洲南瓜高于無殼美洲南瓜，而且從授粉開始至授粉20 d均呈增加趨勢，授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜持續增加，而無殼美洲南瓜則逐漸降低，接近于0。

關鍵詞：美洲南瓜;種皮發育;相關物質;含量

中圖分類號：S642.6? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1001-1463（2020）02-0015-06

Abstract：To study the influence of NaCl stress on the growth and ions transport of flax seedlings， the absorption， distribution and accumulation of saline ions in seedlings of flax were analysed by water culture experiment. The results showed that the fresh and dry weight， the water and chlorophyll content of flax seedlings all increased slightly under NaCl（≤100 mmol/L） stress， and decreased with increasing concentration of NaCl. Whether above-ground or under-ground tissue of flax seedlings， the membrane permeability increased， but the contents of free proline and soluble protein all increased firstly and then decreased slowly with increasing NaCl concentration. The content of Na+ and Cl- in the roots， stems and leaves of flax seedlings all showed increasing trend with increasing NaCl concentration， the accumulation of Na+ and Cl- were in ascending order： stem， root， leaf， and leaf， stem， root， respectively. The loss of Ca2+ and K+ were in ascending order： leaf， stem， root， and stem， root， leaf， respectively. More Na+ were accumulated in leaves of flax seedlings under higher salt stress， which resulted in the more loss of K+ from leaves;the loss of Ca2+ started from roots， which could delay the loss from stem and leaves and then alleviate the salt damage.

Key words：Flax;NaCl stress;Seedlings growth;Ion absorption and transport

裸仁南瓜（Cucurbita pepo L.）是自然界一種罕見的南瓜突變類型，最早在19世紀后期發現[1 - 2 ]。因其瓜子無殼，食用方便，種子含有大量的脂肪、蛋白質、碳水化合物及硒、鈣、鋅、鎂、磷、鐵、鈉等8種主要的微量元素，維生素C、維生素F、維生素B1、維生素B2、維生素H等多種維生素和8種人體必需的氨基酸，營養豐富而享譽國內外市場，成為我國的一種稀有產品[3 ]。

植物種皮來源于胚珠的珠被。據植物科研生產和我們的前期研究，美洲南瓜種皮主要由5層構成，即由外到里依次為表皮層、下皮層、厚壁組織層、軟組織層和綠色組織層[4 ]。關于植物種皮合成過程中物質的變化主要集中在對種皮色素形成相關物質的研究，李曉敏等[5 ]對種子種皮色素進行了分離及種類鑒定，發現甘藍型黑籽油菜和黃籽油菜種皮中均含有花色素、大量黃酮醇、少量的異黃酮昔及黃酮醇昔。擬南芥種皮的成色物質主要為類黃酮類化合物，其中黃酮醇和原花色素積累于種皮中，是種皮色素的主要類 型[6 ]。但是對于種皮發育過程中種皮形成甚至種皮缺失與相關物質含量的變化研究甚少。

我們以武威金蘋果有限責任公司育成的美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28為試材，研究其種皮發育過程中， 種皮鮮重、干重、可溶性糖、淀粉、纖維素、半纖維素和酚類物質的變化規律，尋找 2 個品種種皮產生差異的某些原因，以期為調控種皮發育和進行裸仁南瓜的選育提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

2008年4月30日在武威金蘋果有限責任公司試驗基地播種美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28，于7月上旬即開花盛期進行嚴格自交授粉，每個品種至少授粉10株，并掛牌標記，分別于授粉后10、15、20、25、30、35、40、45、50 d，采集種皮1 g，每個組織共20 g，用錫箔紙包好置于液氮管中帶回實驗室保存于-80 ℃冰柜中。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?種皮鮮重和干重測定? ?采用烘干稱重法[7 ]。從授粉至種子成熟共采集種皮10次，每次采集有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28的種子各10粒，帶回室內洗凈晾干，稱量鮮重;將種皮風干后于80 ℃溫度下烘干至恒重測定其干重。

1.2.2? ?可溶性總糖含量和淀粉含量測定? ?采用蒽酮比色法測種皮可溶性糖及淀粉的含量，繪制葡萄糖含量與光密度的標準曲線[8 ]。測出溶液光密度值后，依標準曲線求出葡萄糖含量，再由以下公式分別計算出可溶性糖含量及淀粉含量。

式中W1為可溶性糖含量，W2為淀粉含量;c（μg/管）為查標準曲線所得葡萄糖含量;a（mL）為顯色時所取樣品量;b（mL）為除色素時吸取提取液的量;V1（mL）為樣品中可溶性糖提取液的量;m（g）為樣品干重;10（mL）為除色素時可溶性糖的溶解體積;V2（mL）為樣品中淀粉水解液總體積;0.9為葡萄糖換算為淀粉的系數。

1.2.3? ?纖維素含量測定? ?采用72%濃硫酸水解法測定種皮纖維素含量[9 ]。稱取0.5～1.0 g種皮置于試管中，加入5 mL醋酸和硝酸混合液，蓋上球形玻蓋，置沸水浴中加熱25 min，并不斷攪拌;取出、冷卻后離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水沖洗3次;向沉淀中加入10 mL質量分數10%的硫酸和10 mL 0.1 mol/L的重鉻酸鉀溶液，搖勻，浸入沸水浴中10 min，取出后倒入三角瓶中，用適量蒸餾水沖洗試管3次，一并倒入三角瓶中;溶液冷卻后加5 mL質量分數20% KI溶液和1 mL質量分數0. 5%的淀粉溶液，用0.2 mol/L硫代硫酸鈉滴定（碘量法），另外單獨滴定加入了10 mL質量分數10%硫酸的0.1 mol/L的重鉻酸鉀溶液10 mL作為空白樣。纖維素含量按公式：X=K（a-b）/（n×24）計算，式中X 為纖維素含量，“24”為1 mol C6H10O5相當于硫代硫酸鈉的當量數;K為硫代硫酸鈉濃度（mol/L）;a為空白滴定所耗硫代硫酸鈉體積（mL）;b為溶液所耗硫代硫酸鈉體積（mL）;n為種皮質量（g）。

1.2.4? ?半纖維素含量測定? ?采用銅碘法。稱取自然風干的種皮粉末0.5～1.0 g，數值為n;裝入小燒杯中，加入15 mL 80%的硝酸鈣溶液，蓋好加熱至沸騰，在慢慢沸騰的情況下加熱5 min分步離心，分別用10 mL熱水洗滌沉淀3次，在沉淀中加入10 mL? ?2 mol/L的鹽酸，攪勻，沸水浴中攪拌情況下微沸45 min，離心，殘渣分別用10 mL蒸餾水沖洗3次，沖洗后的水溶液合并在離心液中，加入1滴酚酞，用2 mol/L氫氧化鈉溶液中和到顯橙紅色，轉入100 mL的容量瓶，稀釋到刻度，用干燥濾紙過濾到干燥燒杯中，移液管吸取10 mL濾液，加入10 mL堿性銅試劑，蓋好在沸水中煮15 min，冷卻，加入5 mL草酸-硫酸混合液，加入0.5 mL 0.5%淀粉，用0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至藍色消失，用去b mL;取10 mL堿性銅試劑，加5 mL草酸-硫酸混合液，再加10 mL濾液，加入0.5 mL 0.5%的淀粉，0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至藍色消失，用去a mL。種皮中半纖維素的含量計算公式：x%=0.9×100[248-（a-b）]（a-b）/10 000×10×n，式中x為半纖維素含量，0.9為還原糖與半纖維素換算系數。

1.2.5? ?酚類物質含量測定? ?參照Rodrigues? ?等[10 ]的方法。取1.0 g冷凍種皮到Ependorf管中，加入1.5 mL的80%甲醇，用鋁箔包裹Ependorf管，防止光氧化，在25 ℃下，用150 r/min振蕩過夜。提取物在12 000轉/g離心5 min，上清液轉移到新的Ependorf管中，在-20 ℃下保存。取上清液（甲醇提取物）150 μL，加入0.25 mol/L的Folin-酚試劑150 μL，搖勻，室溫下保持5 min。接著加入150 μL的1 mol/L Na2CO3溶液，搖勻，在室溫下保持10 min。向混合物加入1 mL雙蒸水，搖勻。室溫下保持1 h。混合物在725 nm下比色，測定吸光度。用鄰苯二酚做標準，單位為mg/g。

2? ?結果與分析

2.1? ?種皮鮮重和干重

種皮鮮重測定結果表明，有殼品種04L Ag-26-2隨著種子的成熟，種皮增厚，鮮重增加;而無殼品種04LAg-26-28的種皮隨種子成熟，種皮鮮重呈下降趨勢。干重測定結果表明，在授粉20 d前，無殼品種04L Ag-26-28的干重高于有殼品種04LAg-26- 2;20 d后，有殼品種04LAg-26-2種皮干重逐漸升高，而無殼品種04LAg-26-28呈降低趨勢（圖1、圖2）。

2.2? ?可溶性總糖含量

參照葡萄糖含量標準曲線（圖3），從圖4可以看出，有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28中可溶性糖含量存在明顯差異，在種子發育過程中，無殼品種04LAg-26-28中可溶性糖含量明顯低于有殼品種04LAg-26-2，而且變化幅度較小，比較平穩。有殼品種04LAg-26-2中可溶性糖含量變化幅度較大。

2.3? ?淀粉含量

參照淀粉含量標準曲線（圖5），從圖6可以看出，有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28中淀粉含量差異較大。無殼品種04LAg-26-28中淀粉含量總體低于有殼品種，變化幅度較大，呈現高—低—高—低趨勢，而有殼品種04LAg-26-2中淀粉含量隨種子的成熟呈降低趨勢。

2.4? ?半纖維素含量

從圖7可以看出，美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28種皮中半纖維素含量存在明顯差異。有殼品種04LAg-26-2授粉后，隨著種子的成熟，半纖維素逐漸增加，直至50 d種子成熟時，含量達到最大值（3.024%）。而無殼品種04LAg- 26-28種皮中半纖維素含量總體呈先增加后降低的趨勢，即授粉后20 d前，其含量和有殼品種04LAg-26-2含量接近，20 d后，隨著種子的成熟，半纖維素含量逐漸降低，直至種子成熟時，含量僅為0.157%。

2.5? ?纖維素含量

纖維素含量測定結果（圖8）表明，美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2種皮纖維素含量均高于無殼品種04LAg-26-28，隨著種子的成熟呈高 — 低 — 高變化趨勢，即從授粉開始至授粉20 d纖維素含量逐漸降低，授粉20 d后，隨著種子的成熟，纖維素含量逐漸增加;而無殼品種04LAg-26-28總體上基本呈降低趨勢，即從授粉開始至授粉20 d，變化趨勢與有殼品種04LAg-26-2相同，但含量低于有殼品種04LAg-26-2，授粉20 d后至種子成熟，纖維素含量持續下降，種子成熟時（授粉后50 d）含量為0.03%。

2.6? ?酚類物質含量

如圖9所示，美洲南瓜有殼品種04LAg- 26-2和無殼品種04LAg-26-28種皮中酚類物質含量變化差異較大，其總體變化趨勢和半纖維素相似。即有殼品種04LAg-26-2授粉后，隨著種子的成熟，酚類物質含量逐漸增加，直至50 d種子成熟時，含量達到最大值。而無殼品種04LAg-26-28種皮中酚類物質含量總體呈先增加后降低的趨勢，即授粉后20 d前，其含量和有殼品種04LAg- 26-2含量接近，20 d后，隨著種子的成熟，酚類物質含量逐漸降低，直至種子成熟時，含量僅為0.313 9 mg/g。

3? ?結論與討論

從授粉至種子成熟，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2種皮鮮重高于無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28，且逐漸增加，而對于種皮干重來說，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2的種皮干重隨種子成熟逐漸增加，無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28種皮干重隨種子成熟逐漸減少，但是，從授粉開始至授粉20d有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2的種皮干重低于無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28。有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2種皮中可溶性糖呈低—高—低趨勢，無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28可溶性糖呈逐漸降低趨勢，且總體上有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2高于無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28;淀粉含量波動較大，總體基本呈降低趨勢，而且無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28低于有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2;纖維素含量無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28低于有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2，從授粉開始至授粉20 d均呈降低趨勢，但授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2逐漸增加，而無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28則逐漸降低;半纖維素和酚類物質的變化趨勢相似，即有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2高于無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28，而且從授粉開始至授粉20 d均呈增加趨勢，授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2持續增加，而無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28則逐漸降低，接近于0。

可溶性糖含量的高低，反映了植株體內可利用態物質和能量的供應基礎[11 ]。糖的大量積累對初生壁的形成和木質素的沉積及纖維素和半纖維素的形成是至關重要的[12 ]。試驗結果表明，美洲南瓜無殼品種04LAg-26-28中可溶性糖含量低于有殼品種中可溶性糖含量，而且美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無殼品種04LAg-26-28在授粉后20 d可溶性糖含量達到最高值，此后持續下降，至種子成熟時，含量接近于0，這說明糖的積累階段，為種皮的正常分裂分化和后期木素沉積提供前體物質基礎。

纖維素、半纖維素是次生木質部細胞壁的主要成分。纖維素是構成細胞壁的主要成分，單位體積纖維素含量的多少直接關系到機械組織是否發達[13 ]。我們通過對無殼美洲南瓜品種04LAg-26-2和有殼美洲南瓜品種04LAg-26-28中纖維素含量比較發現，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2隨種子的成熟，種皮加厚，種皮中纖維素含量持續增加，而無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28隨種子的成熟，種皮退化，纖維素含量顯著降低。

酚類物質是合成木質素的前體，其含量和種類對木質素合成有重要影響，酚類物質自身的氧化交聯和形成的二聚體也可使細胞壁增厚，促進植物組織木質化[14 ]。初生細胞壁酚類物質的累積，促使細胞壁硬化，高等植物細胞次生壁中酚類物質的大量積累提高了細胞壁硬度，阻止了細胞壁延伸，由此可見酚類物質的積累可能在植物細胞壁的停止伸長后在細胞壁硬化中起著一定的作用[11 ]。我們的試驗證明，隨著種子的成熟，有殼美洲南瓜種皮品種04LAg-26-2中的酚類物質含量持續增加，無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28種皮中的酚類物質含量逐漸減少，而且有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2種皮中的酚類物質高于無殼美洲南瓜品種04LAg-26-28種皮中的酚類物質，這與萬政敏等[15 ]對核桃仁種皮中的多酚類物質的研究結果相一致。

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（本文責編：鄭立龍）