脂質組學技術及其在水產中的應用研究進展

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(1.浙江工商大學海洋食品研究院,浙江杭州 310012;2.浙江省水產質量檢測中心,浙江杭州 310023)

脂質是生命機體重要的有機化合物,其不溶于水但易溶解于氯仿、醇、醚等非極性有機溶劑。細胞中的脂質分子大致可分為3 大類,包括極性脂質(糖脂類、鞘脂類和磷脂類)、非極性脂質(膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯)還有脂質代謝物(脂質合成或分解反應的產物)[1]。脂質在生命系統中起到多種作用:脂質構成雙分子層結構使細胞成為整個生命機體中的子單元,相對獨立于外部環境;脂質作為疏水介質,提供了實現膜蛋白的功能并與其相互作用的場所;各脂質分子通過酶反應產生第二信使[2]。

脂質組學是繼基因組學、蛋白質組學、代謝組學后迅速發展的“組學”學科,主要研究脂質參與蛋白質表達和基因調控等過程中的功能、分析脂質在生物體內其結構與代謝途徑、以及研究脂質在生物代謝、免疫等過程中所起到的作用等三大方面[3]。脂質組學在給定的生物系統中對脂質進行分子結構鑒定和成分定量,并試圖闡明單個脂質分子是如何影響脂質代謝和整個系統的功能[4]。脂質代謝在多種與脂質相關的疾病(糖尿病、肥胖癥和阿爾茨海默癥等)研究中起著至關重要的作用,因此脂質組學相關研究得到了越來越廣泛的關注。同時,得益于色譜和質譜技術的快速發展,脂質組學的研究領域也迅速擴張[5],目前已經被應用于包括水產品研究在內的諸多學科和領域。

隨著海洋經濟,尤其是水產品行業的發展,近年來人們對其發展也更加重視,脂質組學在水產品方向的研究應用也日益展開。水產品種類繁多,資源廣泛,目前人們對水產品的消費量和傳統的牲畜相比還有很大差距,但隨著人們消費水平以及消費觀念的改變,水產品的市場需求量正迅速提升,這也帶動了水產品行業的發展,因此對水產品進行更加深入的了解勢在必行。脂質組學這一研究方法為水產品的研究提供了新的思路,使得人們對水產品的研究向更加多元化的方向發展。然而由于水產脂質組學相對起步較晚,目前有關水產脂質組學的研究還正在探索當中。很多檢測技術以及分析方法尚且處在初步探索階段,隨著日后的研究發展,可以建立起一套完整的水產品脂質圖譜,本文從多個方面介紹了水產脂質組學的發展與應用,為水產品鑒定、污染監測、疾病預防等方面未來發展提供科學依據以及技術支持。

1 水產品脂質提取方法

隨著最早Folch提出的氯仿-甲醇體系以來,通過不斷改進優化提取效率和降低毒害性,現已研究衍生出多種脂質提取方法,可針對不同種類的脂質分子極性采取不同技術手段。水產品具有水分含量高,脂質及小分子代謝物雜質少的特點。目前用于水產品中脂質提取主要有氯仿-甲醇體系、甲基叔丁基醚體系、乙醇溶劑體系、超臨界流體萃取、固相萃取等方法。

1.1 氯仿-甲醇體系

氯仿-甲醇法對游離脂和結合脂的提取非常有效,通過此方法可獲得較為純凈的脂質提取物,且提取效率高,在廣義的生命科學領域得到了廣泛應用[5]。Folch等[6]首先提出了以氯仿與甲醇配比為2∶1的混合溶液對動物組織中的脂質進行提取的方法。在此基礎上,Bligh[7]改變了氯仿-甲醇-水的配比,對鱈魚組織中的脂質進行提取,其最終脂質得率提高了53.7%。王少梅等[8]研究探討了簡化氯仿-甲醇法的提取步驟對提取效果的影響,通過對魚體脂肪的提取和含量測定,結果表明試驗過程中可以省去20 h的樣品勻漿步驟,取而代之以樣品在氯仿-甲醇溶液中浸泡2 h以上。盡管經過多年的技術更迭,氯仿-甲醇體系依然是最為經典的脂質提取方法之一。然而氯仿-甲醇法使用了毒性較強的氯仿溶劑,因此本方法僅適用于樣品檢測分析,無法應用于食用性脂質的產業化提取。

1.2 甲基叔丁基醚體系

由于傳統方法中使用的氯仿溶劑對人體和環境的毒性相對較高,科研人員致力于尋找高效、友好的替代溶劑。甲基叔丁基醚(Methyl tertlary butyl ether,MTBE)是一種具有高辛烷值的無色透明溶劑,具有非腐蝕性和化學穩定性,不僅對人體健康威脅小,且在儲存過程中不形成過氧化物,因此不存在降解不穩定的脂類的風險。MTBE法的具體實驗步驟與氯仿-甲醇法類似[9-10],Matyash等[11]用MTBE法對水產品中常見微生物大腸桿菌中脂質進行了提取,證明了MTBE法可以更高效、更清潔地萃取回收脂質。MTBE法與氯仿-甲醇法的主要差別在于MTBE的混合樣品體系離心后,由于MTBE的密度低,在相分離過程中,含有脂質的有機相形成上層,進而簡化了收集過程,更有利于實驗人員移取樣品提取物。

1.3 乙醇溶劑體系

盡管氯仿-甲醇體系和MTBE體系具有較高的脂質提取效率,然而所涉及的溶劑均非食品加工助劑之列,因此并不適用于食品工業的應用。乙醇的生產技術成熟,具備良好的可再生性和安全性。Undeland等[12]向鯡魚組織中先后加入SDS和乙醇,通過漩渦攪拌使蛋白質沉淀,后加入等體積正庚烷均質并離心,分離得到含有鯡魚脂質的有機相。陳麗麗等[13]比較了酶水解-乙醇法、乙醇-正己烷分提法、以及氯仿甲醇法三種方法對淡水魚卵中的脂質和磷脂的提取效率,優化改進了酶水解-乙醇提取技術,采用0 ℃的乙醇,并對樣品均質后再加入等體積的水,使得樣品與水結合更加均勻。郭休玉等[14]基于乙醇為溶劑研究出將磷蝦油的提取應用于工業化生產的方法,通過兩步提取法使蝦油提取率達到15.72%。目前乙醇溶劑體系已成功應用于富含磷脂的南極磷蝦油工業化提取中。

1.4 超臨界流體萃取

超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction,SFE)是近些年被廣泛使用的一種新型分離提取技術,它依據不同化合物在超臨界流體中的溶解度差異,改變體系的溫度和壓力,從而實現不同樣品脂質的提取,同時萃取劑可分離回收并重新壓縮,最大程度節約資源[15-16]。包宗宏等[17]利用CO2-SFE對魚油中的二十碳五烯酸(Eicosapentaennoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(Ducosahexenoic acid,DHA)進行提取,同時對比了Rizvi[18]、Bharath[19]和Nilsson[20]等人利用SC-CO2對魚油脂肪酸的實驗研究,總結出在低溫條件下,選擇合適的萃取壓力,并引入夾帶劑,不飽和程度越高的脂肪酸,其在SC-CO2中的溶解度越高,從而萃取率也就越高。許艷萍等[21]采用CO2-SFE萃取大黃魚魚卵中的油脂,通過正交實驗分析出最佳萃取時間、溫度和壓力,在此條件下萃取率可達86.12%,其中EPA和DHA之和達到19.40%,提高了大黃魚副產物的綜合利用率,豐富了海洋魚油的制備來源。超臨界流體萃取技術以其提取速率高、選擇性強、無毒無溶劑等優點,已被運用于脂質物料的分離提取當中。

1.5 固相萃取

固相萃取(Solid phase extraction,SPE)利用樣品中存在的不同化合物與吸附劑之間的相互作用力不同,使得目標化合物同樣品中的雜質分離,并經過洗脫液的沖刷快速洗脫,從而分離提純該目標化合物。根據所需萃取物的不同以及吸附劑的不同,目前使用較多的固相萃取技術有固相微萃取技術、磁力攪拌棒吸附萃取、以及分子印跡固相萃取技術等。沈清等[22]以烏鱧作為樣本,利用氯仿-甲醇法得到其肌肉組織中的脂質粗提物,隨后討論了不同上樣量、pH、洗脫液濃度以及SPE填裝料對固相萃取的影響,通過對磷脂中甘油磷脂中的磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)回收率的測定從而確定了固相萃取烏鱧肌肉組織中磷脂的最適條件,100 μL的上樣量,pH為2,50%的乙腈溶液1 mL作為洗脫劑,從而對磷脂進行了純化。固相萃取法不需進行相分離,實際操作簡便、節約有機溶劑、提取率高并且可以對微量樣品進行處理。

2 脂質組學檢測技術

脂質組學的概念由Han等[23]于2003年首次提出。盡管脂質組學起步較晚,通過借鑒蛋白質組學、代謝組學的經驗和質譜等精密設備的發展,脂質組學技術在近幾年被廣泛重視并發展迅速,朝著更加準確多元的方向不斷改進。目前已經建立多種適用于脂質分子定性和定量的方法,如直接進樣的鳥槍法、精確定量的液質聯用法等,在試驗中可根據實驗材料及內容合理選擇檢測技術或者多種技術聯用。

2.1 鳥槍法

鳥槍法在脂質組學研究中應用廣泛,根據脂質的理化性質并加以利用,使脂質組的高通量分析更為快捷高效[24]。其步驟是將細胞或組織的總脂質提取物通過針泵直接注入串聯質譜儀中,通過準確測定脂質分子質量或從相應母離子中獲取MS2譜來識別單個分子結構。通過調節溶劑組成(有機相比例、pH、緩沖液濃度)和電離條件(極性模式、電壓能量、霧化溫度等)可使檢測靈敏度提高幾個數量級[25]。Han等[26]應用鳥槍法對脂質提取物中腦苷脂分子進行了ESI-MS檢測和MS/MS結構鑒定,隨后對腦苷脂分子進行定量分析。隨后采用多維質譜分析的鳥槍法脂質組學,確定了800多種脂類分子的水平。崔益瑋等[27]將水產加工副產物中提取的脂質樣品經流動注射直接進樣,通過母離子掃描(Precursor ion scan,PreIS)和中性質量丟失掃描(Neutral loss scan,NLS)實現不同磷脂分子在離子源內的分離鑒定和半定量。鳥槍法在電噴霧電離質譜(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技術基礎上進行了改進,根據脂類特征官能團碎片特征,使多種脂類在一次分析中平行測定。

2.2 液相色譜質譜聯用法

液相色譜質譜聯用(Liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)利用了液相色譜和質譜兩者的優勢,在對復雜樣品各組分進行有效分離的同時還可進行程序化結構測定,實現準確定性與定量分析。根據脂質種類的不同如磷脂類、膽固醇類等，分別利用不同的離子峰提取法(XIC)進行提取,并且基于一系列的固定相的使用,根據各脂質分子之間存在的極性差異以及不同洗脫液的洗脫作用,對同種脂質的不同組分如PC、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine,PE)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)以及PI等進行分離。Shen等[28]使用親水色譜飛行時間質譜(HILIC-QTOF/MS)先后分離洗脫海馬提取物中磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)、PC、PE、PS、PI等磷脂,并利用質譜源內分離各類磷脂中的不同分子。崔益瑋等[29]利用乙醇浸提法制備得到蝦頭廢棄物中的磷脂,并用HPLC-MS技術經負離子模式掃描實現磷脂分子的分離鑒定和定量分析,成功鑒定磷脂碳鏈中的棕櫚酸、亞油酸、二十碳五烯酸和硬脂酸等23 種脂肪酸鏈結構。液相色譜質譜聯用法速度快、靈明度高,并且樣品的前處理過程與分析更加簡單。

2.3 基質輔助激光解吸質譜法

基質輔助激光解吸離子化(Matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)質譜最早應用于蛋白質核酸分析領域[30-32]。隨著該技術的不斷發展,樣品與基質可在單一的有機相中形成均勻的基質/分析物混合物,奠定了將MALDI技術應用于脂質組學的基礎。Schiller等[33]利用氯仿甲醇法提取脂質,以2,5-二羥基苯甲酸為基質與脂質共結晶,應用MALDI-TOF-MS技術對氯仿層中的二酰基甘油、PC和PI等不同種類脂質分析檢測。李國琛[34]通過Folch法對在含鎘水體中不同養殖時間下的鯽魚肉進行磷脂的粗提,隨后采用HPLC將磷脂粗提物中的PC分離純化并進行MALDI-TOF-MS分析,研究了水體中鎘對鯽魚的毒害作用。沈清等[35]采用正離子模式對三文魚樣品中的磷脂提取物進行MALDI離子化分析并進行了方法學驗證,成功對三文魚肌肉組織中28種磷脂分子作出了鑒定。MALDI技術在脂質分析中其最大的優勢在于脂質樣品與常規基質極易共溶于有機溶劑,使得樣品與基體化合物混合物的結晶均勻性極大的提高,從而獲得良好的質譜分辨率。基于MALDI電離的飛行時間質譜法(Time of flight mass spectrometry,TOF-MS)擁有極高的靈敏度,可直接研究水產品細胞膜上的生物功能相關脂質混合物。

2.4 核磁共振技術

圖1 快速蒸發離子化質譜鑒定三文魚和虹鱒魚[42]Fig.1 Discrimination of salmon and rainbow trout by rapid evaporative ionization mass spectrometry[42]

核磁共振波譜法(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)利用自旋原子核在外磁場作用下的核自旋能級躍遷所產生的吸收電磁波譜來鑒定有機化合物結構。在不進行任何化學修飾的情況下,利用高分辨率質子核磁共振波譜可分析獲得全脂提取物及其完整組分的完整信息。Sparling等[36]建立了一種基于高場質子核磁共振光譜的細胞膜脂質快速分析方法,其利用標準脂質特征共振數據庫,成功對脂質混合物的譜峰結構鑒定。Adosraku等[37]采用高效液相色譜法對油脂提取物進行分離,然后采用一維和二維高分辨NMR對細胞膜中提取的脂質進行定量和定性分析,確定了各脂類成分的脂質特征,并且比較了各主要甘油磷脂的脂肪酸類型和組成。NMR作為一種高效的無損檢測技術,在水產品中脂質結構鑒定和含量測定中得到了廣泛的應用,是水產品脂質組學研究重要的技術手段。

2.5 其他檢測技術

隨著脂質組學的研究日益發展,脂質組學的檢測方法也日趨多元化。除了上述涉及的四種方法外,主要還有薄層色譜(Thin-layer chromatography,TLC)、氣相色譜質譜聯用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、毛細管電泳質譜聯用(Capillary electrophoresis with mass spectrometry,CE-MS)、ESI-MS、快速蒸發離子化質譜等檢測技術[38]。TLC是最早應用與脂質分析的一種方法,這種方法快速且經濟,具有較好的分離效率,但是TLC存在靈敏度和分辨率都比較低,而且樣品的制備步驟復雜,對樣品量需求較大,實驗操作中還容易導致不飽和脂類氧化，結構改變。Müthing[39]利用TLC對糖鞘脂類的結構與種類識別做出分析。GC-MS的靈敏度相對薄層色譜法有了顯著提高。Zelles[40]運用GC-MS對脂肪酸進行了定量分析。CE-MS是一種分離能力又高且靈敏度又好的方法,可很好的應用于分離檢測脂質等生物大分子。Hübner[41]利用CE-MS對脂多糖和脂質A進行分離并定量分析。Song等[42]以脂質組學為基礎,建立了基于快速蒸發離子化質譜的三文魚和虹鱒魚鑒別技術(圖1),該方法無需樣品前處理,鑒定結果可實時顯示身份識別率。基于脂質組學的水產品檢測技術日新月異,整體朝著更精確、靈敏、便捷的方向不斷有新的突破。

3 脂質組學在水產研究的應用

3.1 水產脂質輪廓分析

水產品種類眾多,且體內脂質成分多樣,但由于物種不同,其生物體內脂質的含量與種類也存在著差異。目前國內對于水產品脂質組學的研究與利用還未成熟,水產品脂質組學研究尚處于剛剛起步的狀態。利用脂質組學對水產品的脂質進行定性定量分析,從而可以對其脂質輪廓做出總結與統計。勞邦盛等[43]利用氯仿-甲醇法對5種貝類進行脂質的提取,隨后利用氣相色譜質譜聯用對提取的脂肪酸進行了定性分析,測定了其脂肪酸含量。為日后研究提供了科學依據。劉艷青等[44]利用氣相色譜法對皺紋盤鮑內臟的脂質成分進行分析,結果表明其脂質含量豐富并且大多為不飽和脂肪酸,驗證了人們對其營養豐富的認知。多不飽和脂肪酸可降低人體心腦血管疾病,Bandarra等[45]通過氯仿-甲醇法對不同季節的沙丁魚進行脂質提取,采用薄層色譜技術對脂類進行定性和定量分析,發現在5月份沙丁魚體內多不飽和脂肪酸的含量最多,為人工養殖及打撈提供了優化建議,保證了食用沙丁魚的營養水平。通過水產品脂質組學輪廓研究,可以得到各類水產品的脂質信息,從而為其進一步分析利用提供數據基礎。

3.2 品種鑒定和標記物研究

水產品體內脂質成分與含量主要受自身種系、攝食環境等因素的影響,因而理論上利用脂質組學技術可實現水產品種類的區分和產地的溯源。同時由于脂質的普遍存在和化學穩定性,長期以來已經成功的作為分子標記物用于評估有機物在自然環境中的來源和命運,可以準確及時的得到生物體的反饋,做出生物標記物的篩查。Shen等[46]對鯽魚、草魚、鱸魚組織中的磷脂進行提取,采用鳥槍法對比了三者之間磷脂成分的主要差異,從而可以利用磷脂標記物對三種魚肉進行鑒別,為脂質標記物研究提供了新的方法。隨后其團隊[47]針對不同產地的海馬藥材誤標現象,采用HILIC-MS/MS技術研究海馬脂質組學指紋圖譜,比較了海馬品種的脂質差異,正確認識了不同產地的海馬。Pisani等[48]將脂質生物標記物分析應用于尼日爾三角洲東南部地區河口的表層沉積物中的細菌藻類等海洋資源,定量測定了脂族脂類短鏈正構烷烴(

3.3 水產代謝與養殖

脂質組學通過對生物體內脂質的結構以及其在生物代謝過程作用的研究,了解脂質在生物體生長代謝中所起到的作用,對不同脂質的不同作用做出探討,從而對某些生物活動以及功能作出解釋。趙磊等[49]以植物油代替魚油作為為飼料對河蟹進行喂養,采用氣相色譜法對河蟹脂質代謝水平進行了測定,并對河蟹的抗氧化性和免疫性進行研究,了解了不同飼料所帶來的影響,討論了植物油魚油混合飼料的最佳配比。Li等[50]采用氣相色譜法配合火焰電離檢測器(Flame ionization detector,FID)對俄羅斯鱘魚體內脂質進行分析,討論了六種不同的飼料對其脂質代謝、生長性與抗氧化性的影響,為飼料的選擇提供了依據。隨后其團隊[51]以共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)代替魚油對日本沼蝦進行喂養,采用索氏抽提法對脂質進行粗提,然后利用氣相色譜法對其脂肪酸進行分析,得到CLA對于日本沼蝦脂質代謝的影響。通過脂質組學技術研究水產養殖過程中飼料、氣候、環境等不同因素對生物脂質代謝的影響,針對代謝規律優化養殖模式,進而可以提高水產品質和養殖密度。

3.4 水產品加工與貯藏

脂質組學在水產品加工與貯藏方向的研究主要包括水產品脂質成分與加工特性,加工過程中脂質變化對食品理化及生物性質的影響,貯藏過程中脂質的氧化與降解現象等。崔益瑋等[52]將魚類內臟進行二次加工制備得到了魚油和磷脂粗提物,通過氣相色譜和鳥槍法鑒定脂質分子,并以脂質氧化為指標優化了加工工藝,借助脂質組學手段實現了副產物的綜合利用。王昕岑[53]利用直接進樣電噴霧串聯質譜法對不同貯藏溫度下的太平洋鱈魚、南美白對蝦、褶牡蠣的磷脂進行了定性與定量分析,結果表明在較低溫度(如-20 ℃)下,三種水產品的磷脂性質幾乎不發生改變,而在4 ℃時,由于磷脂酶的催化使得磷脂發生降解,故表明了低溫凍藏更加適合于三種水產品的貯藏。Wang等[54]通過鳥槍法脂質組學研究了不同貯藏期的草魚肌肉組織中磷脂變化,揭示了不同階段微生物對磷脂氧化與降解規律。脂質組學的運用可以為水產品的加工提供更加科學有效的方法,降低水產品在運輸貯藏方面的損耗,保證產品質量。

3.5 水產品功能與營養

由于水產品脂質含量豐富,了解脂質在疾病的產生以及治療等方面的作用,從而對疾病對生物體的危害做出預測,在疾病的診斷、新藥的研發、疾病的治療等方面脂質組學都可發揮重大作用,例如水產品中大量不飽和脂肪酸對預防人類心血管疾病等方面有著重要作用。Lankinen等[55]通過脂質組學技術研究了高脂魚類攝入對人體中胰島素抵抗和炎癥相關脂質水平的影響,結果證明脂質是誘導胰島素抵抗和炎癥的潛在介質,食用高脂魚類對動脈粥樣硬化性血管疾病發展有一定的保護作用。Stanley等[56]通過對多名參與者進行特定的魚油補充,運用DI-MS、LC-MS/MS等脂質組學分析方法,對12 個月后人體內EPA和DHA等脂質含量進行測定并與未補充魚油時對比,評估了魚油對于人體健康的影響,揭示了不飽和脂肪酸與人體肥胖程度的關系。通過脂質組學技術研究水產品中脂質的結構與性質,并使其應用于人類機體,調節人體代謝,可為人體補充所需營養素,優化飲食特膳。

4 結論

脂質組學作為代謝組學的一個重要分支,自其概念首次提出以來,通過借鑒蛋白質組學及基因組學研究的經驗,以及科學家們不懈的努力,正一步步的變得更加科學、高效、實用。眾多脂質提取分離方法與脂質組學檢測技術的開發與改進也使得脂質組學的研究更加準確方便。水產品是食品科學中的一門重要分支,脂質組學的應用,逐步深入對水產品中脂質的分析,建立更加完善的研究方法,無疑會為水產品的代謝、加工、貯藏、營養等研究提供了更為有效的技術手段,為學科注入新的活力。水產品中的脂質種類眾多,隨著水產品脂質組學研究的不斷深入,分別對其中各種脂質進行定性與定量分析,并且對其脂肪酸鏈結構以及各種酯化反應進行探究,建立完整的水產品脂質分析體系與數據庫,定會使水產品相關研究以及水產行業走上一個新的高度。