人參多糖對氧化應激損傷肝細胞的保護作用機制研究

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(1.長春中醫藥大學,吉林長春 130117;2.吉林省中醫藥科學院,吉林長春 130012)

人參(PanaxginsengC. A. Mey)為“百草之王”,其功效有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津安神等,其富含的生物活性物質主要包括人參總多糖、人參總皂苷、人參總蛋白等。人參多糖具有增強免疫力[1]、促進造血、降血糖、抗利尿、抗衰老、抗血栓、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種功能。

肝臟在糖異生與糖酵解的作用下維持著人體的能量動態平衡。活性氧(eactive oxygen species,ROS)引發的氧化應激在多種疾病的發病機制中起關鍵作用,肝臟受損及肝臟糖異生功能異常與氧化應激息息相關[2]。目前,恢復機體糖異生功能,降低氧化應激帶來的損傷,修復肝功能成為研究熱點[3]。已有大量研究關于生物活性物質對肝臟的保護作用,Jeon等探究了人參的有效物質對人體肝臟的保護作用[4];王榮等探究了五味子多糖對肝細胞的保護作用[5]；隨著現代研究的不斷深入,研究人員發現人參較其他功能性植物的應用更加廣泛,不但能夠提高機體免疫力,同時能夠保護肝細胞免受損傷[6]。

但從氧化應激的機理方向闡述,人參中的何種成分對肝細胞受損后發揮保護作用尚未研究。本研究通過構建 H2O2誘導的體外大鼠肝細胞氧化損傷模型,探討人參多糖對受損肝細胞的影響和相關機制,為下一步體內實驗提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠肝細胞BRL-3A 武漢普諾賽生命科技有限公司;MEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰酶 美國Hyclone公司;胎牛血清 美國Gibco 公司;DMSO 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;ELISA試劑盒 上海朗頓有限公司;人參樣品 長春中醫藥大學中醫藥大健康創新中心提供;H2O2溶液 sigma公司;羅丹明123、細胞凋亡檢測試劑盒 BD Pharmingen TM;ROS檢測試劑盒 賽默飛世爾科技公司。

二氧化碳細胞培養箱 美國Thermo公司;超凈臺 蘇州凈化有限公司;In-finite200 Pro多功能微孔板分析儀 瑞士Tecan公司;FlowSight多維全景流式細胞儀 Amnis公司;中空纖維系統 上海子起生物科技有限公司;凍干機 深圳市依米科技有限公司;真空干燥箱 上海雅程儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參有效物質的制備

1.2.1.1 人參總蛋白的制備 采用堿提酸沉的方法[7],將100 g人參經過粉粹后,過三號篩(50目),加入10倍量的堿水(pH為8)低溫浸提4 h,過濾,以3500 r/min離心5 min,取上清以0.22 μm中空纖維柱過濾,濾液以HCl溶液調至等電點,靜置1 h后,7000 r/min離心10 min,所得沉淀即為人參總蛋白,凍干機凍干,稱其重量,人參總蛋白收率為3.5%,經BCA試劑盒檢測測得其純度為75%。

1.2.1.2 人參總多糖的制備 采用水提醇沉的方法[8],將100 g人參經過粉碎后,過三號篩(50目),進行100 ℃沸水提取,第一次10倍水,第二次8倍水,分別煎煮2、1 h,過濾后濾液合并,3500 r/min離心5 min,濃縮,用蒸餾水定容至200 mL,加入4倍體積的無水乙醇使藥液終濃度為80%的醇濃度進行醇沉,使其在4 ℃冰箱過夜,離心后所得沉淀即為粗多糖,之后進行sevage法脫蛋白,減壓真空干燥箱烘干,人參總多糖收率為7.8%,經苯酚-濃硫酸法測得純度為63.4%。

1.2.1.3 人參總皂苷的制備 采用超聲波提取法[9-11],將100 g人參經過粉碎后,過三號篩(50目),以60%的乙醇溶液提取,料液比1∶30 (g/mL),提取溫度70 ℃,超聲30 min后3500 r/min離心5 min,取上清,水浴80 ℃蒸干乙醇后,減壓真空干燥箱烘干,人參總皂苷收率為8.3%,根據保健食品功效成分及衛生指標檢驗規范測得純度為70%。

1.2.2 細胞培養 BRL-3A細胞于含10%胎牛血清的MEM培養液在37 ℃,5% CO2的培養箱中培養,取對數生長期細胞用于后續實驗[12-13]。

1.2.3 氧化應激模型的建立 使用MEM培養基將H2O2稀釋至25 μmol/L,采用細胞計數器將大鼠肝細胞(BRL-3A)密度調整到3×104個/mL加到96孔板中,每孔100 μL,放入37 ℃、5% CO2的培養箱中,24 h后將原培養基去除,氧化應激模型組每孔加入含有H2O2,終濃度為25 μmol/L的MEM培養基100 μL,放入37 ℃、5% CO2的培養箱中,作用2 h,即得到氧化應激損傷模型。

1.2.4 人參提取物對氧化應激模型的保護作用 細胞培養瓶中細胞密度達到90%時,吸出培養基,加入0.25%胰酶1 mL,室溫放置1～2 min待培養瓶中細胞消化至圓形時,將胰酶吸出,加入3 mL的MEM培養基,使用吹管將細胞輕輕吹打下來,以1100 r/min的轉速,離心5 min,計數,均勻地鋪至細胞培養板中,培養24 h后,分為對照組、損傷組和給藥組。對照組:MEM培養基正常培養;損傷組:加入終濃度為 25 μmol/L H2O2溶液培養肝細胞2 h,隨后吸出,補加MEM培養基在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h;給藥組:加入終濃度為25 μmol/L H2O2溶液培養肝細胞2 h,隨后吸出,分別用含有人參多糖(0.4、0.8、1.6 mg/mL)、蛋白(0.4、0.8、1.6 mg/mL)皂苷(0.04、0.08、0.16 mg/mL)的MEM培養基作用于受損傷的肝細胞,在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h[14]。

1.2.5 MTT法測定細胞活力 BRL-3A細胞密度調整到3×104個/mL加到96孔板中,每孔100 μL,按照實驗分組干預處理后每孔加入 MTT溶液30 μL,37 ℃繼續孵育4 h,終止培養,加入150 μL DMSO溶解,設置空白孔調零,酶標儀上振蕩3 min后在490 nm波長處檢測各孔OD值,記錄并計算細胞存活率[15]。

1.2.6 SOD及MDA含量的檢測 采用ELISA試劑盒法測定細胞內的SOD及MDA的變化情況,將各組細胞消化洗滌后至液氮中反復凍融三次,以2000 r/min的轉速離心20 min,仔細收集上清用于測定[16]。

1.2.7 細胞凋亡檢測 BRL-3A細胞接種于6孔培養板,密度調整到3×104個/mL,每孔2 mL,按照實驗 1.2.4 分組干預處理后收集細胞,用PBS洗滌細胞3次,1500 r/min離心5 min,取沉淀,加入200 μL 1×Binding buffer懸浮細胞,之后加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后,加入5 μL Propidium Iodied混勻,室溫避光反應15 min,用流式細胞儀檢測,激發波長Ex=488 nm,發射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道檢測,PI紅色熒光通過PI通道檢測。熒光補償調節使用未經凋亡誘導處理的正常細胞作為對照，去除光譜重疊和設定十字門的位置[17]。

1.2.8 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的檢測 BRL-3A細胞接種于6孔培養板,密度調整到3×104個/mL,每孔2 mL,按照實驗分組干預處理后收集細胞,用PBS洗滌細胞3次,加入羅丹明123使其終濃度為2 μmol/L,37 ℃避光孵育30 min,1500 r/min離心5 min,棄上清,加入PBS洗滌細胞3次,最后加入200 μL PBS重懸細胞,使用流式細胞儀檢測,激發波長507 nm,最大發射波長529 nm檢測藥物作用前后熒光強弱[18]。

1.2.9 ROS水平檢測 用MEM培養基稀釋DCFH-DA,終濃度為10 μmol/L。細胞培養結束后,棄掉培養液,每孔加入500 μL濃度為2 μmol/L的 DCFH-DA,在37 ℃的CO2培養箱內孵育30～60 min。用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次,去除未進入細胞內的DCFH-DA,注意不要將細胞吸出。使用流式細胞儀檢測。使用激發波長488 nm,發射波長525 nm,檢測藥物作用前后熒光的強弱。

1.2.10 G6P、PEPCK、ATP酶及肝糖原含量變化 將各組細胞消化洗滌后至液氮中反復凍融三次,2000 r/min離心20 min,仔細收集上清液用于測定,采用ELISA法測定細胞內的G6P、PEPCK、ATP酶及肝糖原的變化[19]。

1.3 數據處理

每個實驗結果均做三次平行實驗,采用SPSS Statistics 17.0計算平均值、標準偏差。通過GraphPad prism軟件進行處理實驗數據,進行t值檢驗。

2 結果與分析

2.1 人參提取物對H2O2損傷BRL-3A細胞的保護作用

圖1 人參總多糖對BRL-3A細胞活力的影響Fig.1 Effects of total ginseng polysaccharides on the activity of BRL-3A cells注:*為給藥組與損傷組的對比呈顯著關系,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);***表示差異非常顯著(P<0.001),****表示差異極其顯著(P<0.0001);#為損傷組與空白對照組的對比呈顯著關系,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01);###表示差異非常顯著(P<0.001),####表示差異極其顯著(P<0.0001);圖2～圖5,圖7～圖12同。

通過對比人參的三種有效物質得到如下結果,經過分析之后,人參總多糖優于人參總蛋白與人參總皂苷,體現在損傷細胞對人參總多糖有濃度依賴性,如圖1,人參多糖作用后,三個給藥濃度(0.4、0.8、1.6 mg/mL)的細胞存活率較損傷組均有所上升,并且中、高劑量有顯著性差異(P<0.05)。同一濃度的總多糖(圖1)與總蛋白(圖3)比較,總多糖恢復作用較好,總蛋白對細胞的作用不強,并且1.6 mg/mL的總蛋白作用后呈下降趨勢。由圖2可知,人參總皂苷對細胞無明顯保護作用,細胞存活率無上升趨勢。故在體外實驗篩選中,最終選定人參總多糖進行后續實驗,進一步探討多糖發揮作用的機制[20-21]。

圖2 人參總皂苷對BRL-3A細胞活力的影響Fig.2 Effects of total ginsenosides on the activity of BRL-3A cells

圖3 人參總蛋白對BRL-3A細胞活力的影響Fig.3 Effects of total ginseng protein on the activity of BRL-3A cells

2.2 氧化應激模型中SOD、MDA的含量變化

肝細胞的氧化應激模型中H2O2導致SOD、MDA的含量急劇變化。SOD是體內重要的抗氧化酶,可催化超氧陰離子和H2O2發生反應,MDA作為脂質過氧化的關鍵標志物,可間接反映細胞遭受氧自由基損害的嚴重程度,協調氧化和抗氧化的平衡[22]。由圖4、圖5可以看出,損傷組胞內的SOD下降、MDA上升,破壞了機體平衡。經不同濃度的人參總多糖作用后,其氧化應激的相應指標得到了極大的改善,即給藥組SOD上升,MDA下降,其中各濃度組MDA含量，中、高濃度組SOD含量較損傷組有顯著差異(P<0.05),并隨著人參多糖濃度的增加,保護作用增強,使受損肝細胞趨于正常水平。

2.3 細胞凋亡結果

圖4 MDA的含量變化Fig.4 MDA content change

圖5 SOD的含量變化Fig.5 SOD content change

圖7 人參總多糖對線粒體膜電位的影響Fig.7 Effects of total polysaccharide of ginseng on mitochondrial membrane potential

采用流式細胞術Annexin V/PI雙染色定量檢測細胞凋亡程度,其中R4與R5分別表示晚期凋亡與早期凋亡的細胞[23],由圖6結果顯示經不同濃度人參總多糖保護后可顯著降低H2O2誘導的BRL-3A細胞凋亡(P<0.05),細胞早期凋亡與晚期凋亡均有所改善,在人參總多糖低濃度的作用下,減少了細胞的早期凋亡,中、高濃度作用下,同時減少了早期與晚期凋亡。隨著濃度的升高,其保護作用逐漸增強,減少了細胞凋亡的發生,為下一步探究藥物發揮作用的機制提供基礎。

2.4 線粒體膜電位的檢測

線粒體膜電位異常作為細胞凋亡發生的最早期事件,研究發現,在凋亡信號的刺激下,線粒體的膜電位丟失,使線粒體膜的通透性發生變化,各種凋亡因子會從線粒體釋放到細胞質中,從而導致了線粒體膜電位的下降[24]。實驗結果(圖7)顯示經過氧化氫損傷后,線粒體膜電位下降,隨著人參總多糖藥物濃度的上升,經流式細胞儀測定后,線粒體膜電位的中值均有顯著性提高(P<0.05)。

圖6 人參總多糖對細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of total polysaccharide of ginseng on cell apoptosis

2.5 ROS含量變化

細胞中活性氧(ROS)等自由基主要由線粒體產生,高濃度的ROS會造成氧化損傷,導致線粒體功能的喪失,最終誘發細胞凋亡[25],結果如圖8所示,肝細胞的氧化應激模型中導致損傷組ROS升高,通過低、中、高三個濃度的人參總多糖作用后,其氧化應激的ROS指標逐漸下降,并有顯著性差異(P<0.05)，使受損肝細胞得到保護。

圖8 人參總多糖對ROS的影響Fig.8 Effect of total polysaccharide of ginseng on ROS

2.6 糖異生功能的恢復(G6P、PEPCK及ATP酶)

糖異生的作用是為人體提供能量,是肝臟的功能之一,如圖9、圖10所示,損傷組與空白對照組比較,糖異生的關鍵酶含量顯著下降(P<0.05),影響了糖異生的功能,從而影響了肝細胞生成糖原的能力。經過低、中、高三個濃度的人參總多糖作用后G6P、PEPCK的活力恢復。推測人參多糖作用后,激發了G6P、PEPCK所在的信號通路,為下一步QPCR與WB水平檢測提供數據支撐。

圖9 人參總多糖作用下G6P的變化情況Fig.9 Changes in G6P under the action of total polysaccharides from ginseng

圖10 人參總多糖對PEPCK的影響Fig.10 Effect of total polysaccharide of ginseng on PEPCK

經損傷后同樣影響了肝細胞線粒體中ATP酶的改變,ATP酶為評價線粒體功能與能量代謝的重要指標,如圖11所示。給藥后ATP 酶的活力較損傷組極顯著上升(P<0.01),人參總多糖可能通過改善線粒體的功能來恢復受損肝細胞的功能[26],同時,ATP酶與G6P給藥后含量顯著升高(P<0.05),分析可能與過氧化氫與藥物共同誘導所致。

圖11 人參總多糖對ATP酶的影響Fig.11 Effect of total polysaccharide of ginseng on atpase

2.7 肝糖原的含量變化

肝糖原是人體生命運動能量的重要來源,肝臟作為能量代謝的樞紐,其重要作用是產生糖原,糖原的儲存量可直接影響機體的運動能力[27],如圖12所示,損傷組經過損傷之后,肝糖原的含量減少,低、中、高人參總多糖干預后,肝糖原含量呈梯度增長,提高糖原儲備量有助于糖異生功能的恢復,給藥組肝糖原含量比損傷組明顯升高,即增加能量物質的儲備能力增強,肝臟糖異生功能恢復,從而恢復受損肝細胞的功能。

圖12 人參總多糖對肝糖原的影響Fig.12 Effect of total polysaccharide of ginseng on hepatic glycogen

3 結論與討論

本研究采用了過氧化氫對肝細胞損傷,模擬氧化應激的損害,實驗模型組顯示肝糖原含量下降,SOD降低,MDA升高,表明肝細胞功能已受到損傷,當糖原含量不足,不能為生命活動提供充足能量時,進而導致疾病的發生,同時大量的ROS將會破壞肝臟線粒體功能及糖異生功能等[28],高進濤等研究了氧化應激對Hacat細胞的保護作用;李雪惠等探討了氧化應激對心肌細胞危害[29-30],均通過SOD與MDA的變化初步闡述了氧化應激造成的損傷,但對于藥物對氧化應激造成損傷的保護作用機制尚未研究。

現代醫學認為能量代謝與ATP的產生息息相關,線粒體及糖異生功能受損導致肝臟不能進行正常的能量代謝,肝糖原產生量減少,肝功能作用減弱。本實驗結果顯示,人參多糖作用后,肝臟產生肝糖原的量較損傷組有顯著性上升(P<0.05),同時葡萄糖-6-磷酸酶與磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶含量上升,糖異生作用在一定程度下恢復,人參具有雙向調節的作用,當糖異生功能過強時,及時對其進行抑制[31]。

氧化應激導致的肝細胞損傷使細胞中的SOD穩態被破壞,而MDA的增加影響了ATP的釋放,阻礙了肝細胞線粒體的功能,人參多糖作用后,肝細胞凋亡較損傷組減弱,線粒體膜電位回升,ATP酶含量升高,故肝臟能量代謝功能恢復,人參多糖經過升高SOD,降低MDA來減輕氧化應激帶來的損傷。

本研究表明,人參多糖對氧化應激造成的肝細胞損傷有一定的保護作用,而氧化應激與人體疲勞等息息相關,故為下一步人參補氣提供數據支撐。