乙醇熏蒸對采后甜櫻桃的保鮮效果

楊曉哲1,3,胡文忠，*,姜愛麗,修志龍1,姬亞茹1,3,楊香艷,蔣海峰

(1.大連理工大學生物工程學院,遼寧大連 116024;2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;3.生物技術與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連 116600)

甜櫻桃(sweet cherry)果實顏色艷麗,酸甜可口,含有豐富的營養物質,富含蔗糖、葡萄糖和山梨醇,且蘋果酸、檸檬酸、莽草酸和富馬酸等有機酸含量比較高[1]。具有多種保健功能[2-3],因其鐵的含量非常豐富,還具有促進血紅蛋白再生、抗貧血的功效,因此,甜櫻桃被稱為“超級保健水果”[4]。甜櫻桃皮薄多汁,組織柔軟,并且收獲季節的溫度和濕度比較高,極易受到病原菌的侵染而導致腐爛[5],從而使甜櫻桃的貯藏和加工成為一個難題。現有的保鮮技術由于在某些方面的局限性已不能滿足對甜櫻桃保鮮的需要[6]。因此,從采后甜櫻桃病害、生理生化及品質等角度出發,研究安全有效的保鮮技術具有重大意義。

據報道,每年甜櫻桃果實因采后病害引起的腐爛損耗占總產量的25%～50%[7]。甜櫻桃最容易感染和最難防治的病蟲害主要有灰霉病、褐腐病、病毒病、流膠病等[8],目前研究多集中在真菌性病害如青霉病(Penicilliumexpansum)、灰霉病(Botrytiscinerea)、軟腐病(Rhizopussp.)、褐腐病(Moniliniafructicola)、綠腐病(Cladosporiumherbarum)、交鏈孢霉腐病(Altematalternata)[9]。目前,國內外在甜櫻桃采后病害防治和貯藏保鮮方面采用的技術手段主要有低溫貯藏[10]、氣調貯藏[11]、高壓脈沖電場殺菌[12]、輻照殺菌[13]等物理保鮮技術;二氧化氯浸泡、氯化鈣[14]等化學方法保鮮;拮抗菌[15]等生物保鮮技術等。

乙醇作為果蔬自身的代謝產物,具有很強的殺菌作用,已被美國FDA認證為是安全物質(GRAS)[16]。研究表明,300 μL/L的乙醇有效控制了采后枇杷炭疽病(anthracnose rot)的發生[17]。近幾年,乙醇在葡萄[18]、甜瓜[19]、腰果梨[20]等果蔬的保鮮上都取得了顯著的效果。Wang等[21]利用250、500 μL/L乙醇蒸汽結合熱空氣的手段對楊梅采后病害進行控制,研究發現500 μL/L濃度的乙醇結合熱空氣處理有效抑制了楊梅采后由楊梅輪帚霉(Verticicladiellaabietina)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)和綠色木霉(Trichodermaviride)引起的病害。乙醇在不同類型果實的保鮮應用上存在差異,目前,國內外關于乙醇對采后甜櫻桃果實灰霉病的控制及其生理代謝與品質的影響還鮮有報道,為此,本研究以新鮮甜櫻桃(薩米脫,summit)為試驗材料,用不同濃度乙醇進行熏蒸處理,探討乙醇對甜櫻桃采后灰霉病的控制及品質的影響,旨在為甜櫻桃貯藏保鮮提供理論與應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用甜櫻桃品種為“薩米脫(summit)”,采自大連市金州區甜櫻桃園,選取無機械損傷和病蟲害、成熟度一致(九成熟)的果實,采后立即運回實驗室,在0～4 ℃下預冷24 h后備用；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 北京奧博星生物技術有限責任公司;吐溫-80 天津市津南區咸水沽工業園區;無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、氫氧化鈉、草酸、抗壞血酸、2,6-二氯酚靛酚、鄰苯二甲酸氫鉀(分析純) 上海國藥集團。

AL240型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Lamda-25 紫外可見分光光度計UV-9200 北京瑞利分析儀器有限公司;美國PEGC-2010型氣相色譜儀 日本島津公司;BR4i型臺式高速冷凍離心機 法國Jouan公司;GY-I型果實硬度計 上海梅特勒-托利多有限公司;T25型勻漿機 德國IKA公司;SIM F140-型制冰機 日本三洋有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;TA. XT Plus型質構儀 英國SMSTA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰霉菌孢子懸液的制備 試驗中所使用的灰霉菌(Botrytiscinerea)是本實驗室前期從腐爛的甜櫻桃果實中分離純化并鑒定獲得的。使用前,在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)上于25 ℃下活化培養5 d,借助血球計數板計數,用體積分數為0.05%的吐溫-80調整至3×106cfu/mL的孢子懸浮液,備用。

1.2.2 乙醇熏蒸對灰霉菌的體外試驗 用已滅菌的PDA培養基制作平板,每板15～20 mL,待培養基完全凝固后,用無菌打孔器在平板中央打取直徑6 mm的孔,注入已制備好的孢子懸浮液20 μL。在培養皿蓋子上放置一片無菌的直徑為6 mm的濾紙。分別取一定體積(15.75、31.50、63.00 μL)的無水乙醇滴于濾紙片上,以不加乙醇的濾紙片的平板為對照,使體積為63 mL平板(90 mm×10 mm)內的乙醇濃度分別為0、250、500、1000 μL/L(v/v),將平板用封口膜密封,于25 ℃培養箱中培養3 d后觀察抑菌效果并測量菌斑直徑。

1.2.3 乙醇熏蒸對甜櫻桃人工接種灰霉菌的體內試驗 將已挑選好的新鮮甜櫻桃(約12 kg)洗凈并在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min,用自來水沖洗后晾干。然后用滅菌牙簽在甜櫻桃果實赤道部位刺一個直徑約2 mm,深約3 mm的孔,向孔中注入20 μL孢子濃度為3×106cfu/mL的菌懸液,于通風櫥中晾干,置于密閉箱中,密閉箱內的乙醇濃度分別為0、250、500、1000 μL/L,于25 ℃下熏蒸12 h,然后通風30 min,并置于25 ℃下密封貯藏,每隔3 d觀察病害情況。

1.2.4 乙醇熏蒸對新鮮甜櫻桃果實生理生化和品質的影響 將未進行任何處理的新鮮甜櫻桃直接放置于密閉箱中,每箱放置3 kg,密閉箱內的乙醇濃度分別為0、250、500、1000 μL/L,于4 ℃下熏蒸12 h,然后通風30 min,通風結束后于4 ℃密封貯藏,每隔3 d取樣對生理生化指標進行測定。

1.3 指標測定方法

1.3.1 失重率和腐爛率 分別從實驗組和對照組隨機挑取15個甜櫻桃,置于白色托盤中,并用保鮮膜包裝,于4 ℃貯藏,每隔6 d進行失重率和腐爛率的測定,做3個重復。果實腐爛率(%)=(腐爛果實數/總果實數)×100。腐爛果實是指果實表面存在1/3破損或褐變現象或存在菌絲體生長現象的果實。

1.3.2 硬度、呼吸強度、可滴定酸 果實硬度采用手持GY-I型硬度計測定。設3個重復,每個重復測定10個果實。

利用氣相色譜法測定呼吸強度,將200 g樣品放在呼吸盒中靜置1 h,用針抽取1 mL氣體用GC-2010型氣相色譜儀進行測定。檢測器采用熱傳導檢測器(TCD),色譜柱采用Alhech ctrl column,載氣為氦氣,流速3 mL/min,進樣口和檢測器溫度均為120 ℃,柱溫保持在30 ℃。

利用氫氧化鈉滴定法測定樣品中可滴定酸含量[22]。

1.3.3 PPO酶活 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性的測定參照杜小琴[23]的方法,略有修改。稱取2.5 g樣品,加入2.5 mL提取緩沖液,冰浴勻漿,于4 ℃、12000×g離心30 min,收集上清液,即酶提取液,低溫保存備用。在3 mL 0.5 mol/L的鄰苯二酚溶液的反應體系中加0.5 mL酶液,反應溫度為25 ℃,加酶液5 s后開始掃描,記錄10 s內OD398值的變化,重復3次。酶活性單位表示為ΔOD398/min·g。

1.3.4 POD酶活 過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性的測定參照靳苗苗等[24]的方法,分別以每克果實每分鐘在460 nm條件下吸光值變化1為1個酶活單位,結果以U/g表示,重復測定3次取平均值。

1.4 數據統計分析

所有指標均采用3個樣品重復測定取平均值。采用SPSS 17.0進行數據處理分析,用鄧肯多重比較方法進行差異顯著性檢驗,0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 不同濃度乙醇熏蒸對灰霉菌的體外抑制效果

如圖1所示,當用0、250、500、1000 μL/L的乙醇對灰霉菌進行體外熏蒸實驗時,隨著乙醇濃度的增加,對平板上灰霉菌的抑制效果逐漸增強,接種培養3 d后,1000 μL/L濃度乙醇熏蒸處理組的抑菌效果顯著高于其它三組(P<0.05)。培養至6 d后,對照組的菌絲基本長滿平板,500和1000 μL/L處理組的抑制效果較好,但二者差異不顯著(P>0.05)。這說明,乙醇熏蒸處理能有效地降低甜櫻桃果實灰霉病的發病率,減緩病斑的擴展。

圖1 不同濃度乙醇對灰霉菌的體外抑制效果(25 ℃)Fig.1 Inhibition of different concentrations of ethanol on Botrytis cinereal in vitro at 25 ℃

2.2 不同濃度乙醇熏蒸對灰霉菌的體內抑制效果

圖2為不同濃度乙醇熏蒸對灰霉菌的體內抑制測試結果,通過對甜櫻桃果實進行人工接種灰霉菌,于25 ℃條件下,貯藏4 d后的病害情況。從圖中可以看出,0 μL/L(a)和250 μL/L(b)處理組的菌絲明顯,菌斑直徑在1 cm左右且差異不顯著(P>0.05),500 μL/L處理組的病害情況不明顯,菌斑直徑只有0.5 cm左右,1000 μL/L處理組幾乎沒有發生病害,實驗結果表明,隨著乙醇濃度的增加,對病害甜櫻桃上灰霉菌的抑制效果增強。

圖2 25 ℃下不同濃度乙醇對灰霉菌的體內抑制效果Fig.2 Inhibition of different concentrations of ethanol on Botrytis cinereal in vivo at 25 ℃注:a:0 μL/L;b:250 μL/L;c:500 μL/L;d:1000 μL/L。

2.3 不同濃度乙醇熏蒸處理對甜櫻桃果實呼吸強度的影響

呼吸強度是衡量果實成熟衰老速度、生理代謝速率及保鮮效果的一個重要指標。由圖3可以看出,貯藏期間,所有處理組的呼吸強度呈先上升后下降的趨勢,500 μL/L處理組的果實在第6 d出現呼吸峰,而后呈迅速下降趨勢,下降速率最快(P<0.05),18 d后又有所升高,分析原因可能是后期出現腐爛現象導致的。對照組在第12 d出現呼吸高峰,12 d后有所下降,但下降趨勢不明顯,且整個貯藏期間對照組果實的呼吸強度始終最大,第12 d時與三個處理組的差異顯著(P<0.05),其中與500 μL/L處理組的差異最大(P<0.01)。24 d時,對照組與250、1000 μL/L處理組的呼吸強度相差不大(P>0.05)。結果表明,乙醇熏蒸處理能夠抑制甜櫻桃果實貯藏期間的呼吸強度,且500 μL/L的乙醇抑制效果最顯著。乙醇抑制呼吸強度可能是通過抑制乙烯的生物合成,從而影響乙烯誘導的呼吸升高;也可能是通過抑制線粒體功能和相關酶活性的原因[25]。這在乙醇處理的鮮切蓮藕[26]和甜瓜[27]中已經得到證實。

圖3 不同濃度乙醇處理對甜櫻桃果實呼吸強度的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ethanol on respiration of sweet cherry

2.4 不同濃度乙醇熏蒸處理對甜櫻桃果實硬度的影響

果實硬度能夠直接反映果實的貯藏效果和果實軟化程度,是衡量果實品質的重要指標之一[28]。如圖4所示,各組果實的硬度均隨貯藏時間的延長而下降,其中0 μL/L處理組果實的硬度始終最低,且下降速率比處理組大,差異顯著(P<0.05)。從第6 d開始,500 μL/L處理的果實硬度始終最高,與250、1000 μL/L兩個處理組的差異顯著(P<0.05),而250和1000 μL/L處理組的硬度相差不顯著(P>0.05)。據報道,當果實的細胞膜與乙醇相互作用時,細胞膜的透水性降低,對維持果實的硬度起到了重要的作用[29];也可能與抑制細胞壁降解相關酶(多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、果膠甲酯酶和β-半乳糖苷酶)的活性有關[30]。

圖4 不同濃度乙醇處理對甜櫻桃果實硬度的影響Fig.4 Effects of different concentrations of ethanol on the hardness of sweet cherry

2.5 不同濃度乙醇熏蒸處理對甜櫻桃果實失重率和腐爛率的影響

貯藏期間的新鮮果蔬,極易發生水分散失,導致果實軟化和萎蔫,從而加速果蔬的衰老。因此,尋找有效的保鮮技術抑制果蔬貯藏過程中自身水分的過度散失,越來越成為保鮮研究的熱點[31]。由圖5(a)可以看出,隨著貯藏時間的延長,各個處理組甜櫻桃果實的失重率均呈上升趨勢,在整個貯藏過程中,500 μL/L處理組的失重率始終低于其它組,貯藏24 d后,500 μL/L處理組的失重率與其它組的差異極顯著(P<0.01),而0、250、1000 μL/L三個處理組的失重率相當,差異不顯著(P>0.05)。因此,500 μL/L的乙醇熏蒸處理可以更好地抑制甜櫻桃果實水分的散失,保持更高的新鮮度。同樣,類似的實驗結果在枇杷上得到驗證,2 mL/kg乙醇能夠保持枇杷較高的出汁率[32]。這可能是由于一定濃度的乙醇作為脂肪醇溶解在膜脂雙層中,增強細胞膜的穩定性和疏水性;也可能是由于乙醇使細胞保持較高的滲透壓,阻礙水分向細胞壁和細胞間隙滲透,從而降低失重[33]。

腐爛率是評價果實貯藏效果的主要指標。腐爛率以甜櫻桃果實表面發生汁液外漏、長菌或腐爛現象作為判別依據。0、250 μL/L處理組從12 d開始發生腐爛,二者在24 d時的腐爛率差異不顯著(P>0.05)。對照組的腐爛率始終高于處理組,500、1000 μL/L處理組從18 d開始出現腐爛現象,且500 μL/L處理組的腐爛率最低,與其它組的差異顯著(P<0.05)。Dong等[34]通過研究不同濃度乙醇(400、600、1000 μL/L)熏蒸對馬鈴薯保鮮效果的影響,發現當乙醇濃度超過600 μL/L時,會導致馬鈴薯的腐爛;同樣,類似的實驗結果也在其它果蔬上得到驗證,高濃度乙醇加速了枇杷果實的腐爛,正是由于過量的乙醇對果實細胞產生毒害加速衰老腐爛的結果[35]。

圖5 不同濃度乙醇處理對甜櫻桃果實失重率(a)和腐爛率(b)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of ethanol on weight loss rate(a)and decay rate(b)of sweet cherry

2.6 不同濃度乙醇熏蒸處理對甜櫻桃果實可滴定酸含量的影響

果實在貯藏過程中為了維持正常的呼吸作用,需要消耗糖、酸等有機物,可滴定酸含量的變化反映了果肉細胞內營養物質的消耗速率和程度,且可滴定酸的含量與果實的風味有很大的關聯性,因此,可滴定酸含量是衡量果實采后風味變化和保鮮效果的重要指標之一[36]。如圖6所示,在整個貯藏過程中,可滴定酸含量呈逐漸下降趨勢,總體上看,500 μL/L處理組的下降趨勢最緩慢,貯藏24 d后,500 μL/L處理組的可滴定酸含量是0 μL/L處理組的1.24倍,分別是其它兩個處理組的1倍。結果說明乙醇熏蒸可以延緩甜櫻桃可滴定酸含量的下降,且500 μL/L濃度乙醇處理的效果最顯著(P<0.05)。

圖6 不同濃度乙醇處理對甜櫻桃果實可滴定酸含量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of ethanol on titratable acid content of sweet cherry

2.7 不同濃度乙醇熏蒸處理對甜櫻桃果實PPO活性的影響

多酚氧化酶(PPO)與果蔬的褐變有著直接的聯系,酶褐變現象是果蔬中的酚類化合物被多酚氧化酶催化氧化后,經一系列的聚合反應生成色素的過程。多酚氧化酶的含量是衡量果實成熟的指標之一[37]。果肉組織中的PPO存在結合態(BPPO)和可溶態(FPPO),果實在貯藏過程中,由于各種原因會造成組織細胞的傷害,導致BPPO向FPPO轉變,并且因果肉組織細胞膜降解使體內原本分離的FPPO氧化酶系統與酚類物質作用,形成醌類物質,并進一步聚合成褐色產物,嚴重影響著果實的營養、風味及外觀品質[38]。

由圖7可知,經不同濃度乙醇熏蒸處理后,貯藏過程中甜櫻桃果實的PPO活性呈先升高后下降的趨勢,在貯藏的第12 d,各組PPO活性達到峰值,其中0 μL/L處理組的峰值最大,500 μL/L處理組的峰值最小,二者差異顯著(P<0.05),而0 μL/ L處理組與250、1000 μL/L處理組的相差不大(P>0.05)。貯藏12 d后,各組的PPO活性開始下降,其中0 μL/ L處理組的下降速率最慢,500 μL/L處理組的PPO活性一直處于最低狀態,且與其它各組的差異顯著(P<0.05)。以上結果表明,乙醇熏蒸處理可以降低甜櫻桃果實貯藏過程中的PPO活性,但乙醇濃度不同,抑制效果也存在一定的差異,500 μL/L的抑制效果最佳,該結果與郭禹等的結果一致[39]。

圖7 不同濃度乙醇處理對甜櫻桃果實PPO活性的影響Fig.7 Effects of different concentrations of ethanol on the PPO activity of sweet cherry

2.8 不同濃度乙醇熏蒸處理對甜櫻桃果實POD活性的影響

POD能夠催化水和有機過氧化物對植物細胞內多種有機物和無機物的氧化分解作用。POD活性的升高,既能夠有效地清除內源活性氧自由基,還有利于植物木質素和植保素的合成。圖8表明,整個貯藏期間,各乙醇處理組甜櫻桃果實POD活性均呈先上升后下降的趨勢,250、500、1000 μL/L處理組果實的POD活性始終高于0 μL/ L處理組,其中500 μL/L處理組的POD活性顯著高于其他組(P<0.05),且在貯藏第12 d出現一次活性高峰。在貯藏前期,隨著貯藏時間的延長,由于甜櫻桃果實逐漸衰老導致代謝產生的自由基逐漸增多,誘導了果實POD活性的增強;貯藏后期,由于果實本身抗氧化性增強,能清除自身的自由基,POD激發活性而呈下降趨勢[40]。

從甜櫻桃果實POD活性的變化來看,乙醇處理在一定程度上刺激POD活性增加,可能是因為乙醇處理過程中快速積累了過氧化物,誘導機體抗性體系的增強,提高了POD活性,加強保護系統清除自由基的能力,有助于克服膜脂過氧化現象[41]。試驗結果表明,500 μL/L乙醇處理有增強果實POD活性的作用,確保組織免受活性氧的傷害,同時延緩果實在貯藏過程中的衰老進程。

且乙醇熏蒸處理能維持甜櫻桃的POD活性,有利于減緩果實衰老的速度。由圖8可知,在貯藏過程中,甜櫻桃果實中的POD活性整體呈現下降趨勢,500 μL/L乙醇處理組的POD活性在第12 d時出現峰值,0 μL/ L處理組POD活性下降速度最快。

圖8 不同濃度乙醇處理對甜櫻桃果實POD活性的影響Fig.8 Effects of different concentrations of ethanol on POD activity of sweet cherry

3 結論

乙醇作為一種安全無毒、綠色無污染、添加量不受限制的食品保鮮物質,其保鮮效果已在多種水果和蔬菜上得到了證明。國內外已有大量研究表明,乙醇熏蒸可以抑制果蔬采后成熟衰老、延長壽命,降低果蔬采后貯藏過程中的呼吸速率,使微生物的活動受到抑制。本研究中發現,乙醇熏蒸對甜櫻桃具有一定的保鮮效果,且乙醇濃度不同,保鮮效果也存在差異,其中500 μL/L濃度的乙醇對甜櫻桃的保鮮效果最顯著,能夠延緩甜櫻桃果實軟化的進程,延緩水分的散失,抑制呼吸作用,維持較高的硬度和可滴定酸含量,且使貯藏過程中的PPO活性處于最低,減緩褐變程度;乙醇熏蒸處理可以防止甜櫻桃灰霉病的發生,且從體內和體外熏蒸實驗結果可以得出,1000 μL/L濃度的乙醇抑菌效果最好,但對果實品質影響較大。綜上所述,乙醇熏蒸處理能夠減少采后甜櫻桃的腐爛變質,延緩果實衰老進程,提高抗病性,從而保持果實的品質,其中以500 μL/L的乙醇處理效果最佳。