甘肅隴南大紅袍花椒芳香油成分分析及其抑菌活性

,*

(1.西北師范大學,生命科學學院,甘肅蘭州 730000;2.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術研究中心,甘肅蘭州 730070)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是蕓香科花椒屬植物。據目前研究我國現有45種不同的花椒,其中有13種屬于變種花椒[1]。其在我國分布廣泛,主要分布在四川、陜西、山西、甘肅等地區[2]。花椒中含有生物堿、脂肪酸、香豆素、木脂素、酰胺、芳香油等化學成分,在這些化學成分中芳香油的含量最高[3-4]。中醫認為,花椒性溫,味辛,除了可以作為調味品外,還具有眾多藥用功效,包括鎮痛、麻醉、抗菌、殺蟲、抗氧化等,在醫藥方面具有廣泛的應用前景[5-6]。大紅袍為蕓香科落葉灌木或小喬蜀椒的果實,果皮名椒紅,其被譽為“八大調味品”之一。研究表明大紅袍花椒中不僅含有大量的芳香油成分,而且還含有豐富的脂肪油成分,主要包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、花生酸等成分,經過提煉可以達到食用油的標準,是一種藥食同源物質[7]。

甘肅省隴南市武都區栽植花椒歷史悠久,自古就是優質花椒的故鄉,素有“千年椒鄉”之美譽。花椒適生范圍廣,全區36個鄉鎮中有34個鄉鎮適宜發展花椒產業。其盛產的花椒品質優異,民間冠以“大紅袍”之稱。“大紅袍”花椒粒大飽滿、麻味醇厚,其提取的芳香油含量高,且藥效成分較多[8]。

對于花椒芳香油化學成分分析和抑菌效果研究,國內外學者主要研究的是不同地區大紅袍花椒芳香油的化學成分和抑菌效果,但是對于甘肅隴南地區的大紅袍花椒揮發油的化學成分和抑菌方面的研究未見報道。唐裕芳等[9]采用水蒸氣蒸餾法提取四川紅皮花椒中的芳香油,運用GC-MS對其成分進行分析鑒定,并對芳香油進行抑菌活性研究,研究發現花椒芳香油中含有的烯醇及其酯類衍生物、萜烯類化合物等物質,具有較強的抑菌活性。干信等[10]采用水蒸氣蒸餾法提取陜西大紅袍花椒中的芳香油,并對其芳香油的抑菌性進行研究,研究發現花椒芳香油不僅能抑制革蘭氏陰性菌,也能抑制革蘭氏陽性菌,同時對霉菌、真菌也有抑制作用,尤其對青霉和黑曲霉的抑菌效果最好。本文以甘肅隴南的大紅袍花椒為研究對象,采用水蒸氣蒸餾法提取其花椒芳香油,并對芳香油的化學成分和抑菌性進行分析研究,為隴南花椒的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大紅袍花椒 采自甘肅隴南地區;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CMCC 26003)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)、破傷風桿菌(Nicolaieri’sbacillus,ATCC 19406)、熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescence,ATCC 13525) 供試致病菌由西北師范大學微生物實驗室提供;乙醚(AR) 天津市津冬天正精細化學試劑廠。

7890A型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;DRT-TW型調熱電熱套、JY2002型電子天平 力辰科技公司;BSC-1300ⅡA2生物安全柜 蘇州安泰公司;TS-100C恒溫搖床 上海天呈公司;YXQ-SG46-280S高壓滅菌鍋 北京中西公司;營養培養基(LB) 南通凱恒生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芳香油提取 參照文獻[11]中提取芳香油的方法,進行修改。稱取樣品100 g粉碎并過30目篩,裝入2000 mL的圓底燒瓶中,加蒸餾水800 mL及數粒玻璃珠,浸泡過夜,連接揮發油測定器及回流冷凝管,并在揮發油測定器中加入蒸餾水至溢流入圓底燒瓶中,將圓底燒瓶于電熱套上加熱,調節加熱溫度為120 ℃,蒸餾10 h后,停止加熱并冷卻。從揮發油測定器中放出提取物轉移至分液漏斗,加入少量乙醚進行萃取,過濾,常溫下揮干乙醚,得到黃色有特殊香味的芳香油,稱重計算得油率為6.223%,4 ℃冰箱保存待測。

1.2.2 芳香油的測定條件

1.2.2.1 氣相色譜分析條件 氣相色譜條件:石英毛細管柱HP-5MS,30 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm;升溫程序:初始溫度60 ℃以10 ℃/min升至210 ℃,保持2 min,再以4 ℃/min升至280 ℃,保持2 min;載氣:He;柱流量:1 mL/min;進樣口溫度:280 ℃[12]。

1.2.2.2 質譜分析條件 質譜條件:EI源;電離電壓:70 eV;離子源溫度:250 ℃;掃描范圍:50～650 amu;進樣量:2 μL;分流比:20∶1。

1.2.3 不同大紅袍花椒芳香油成分的對比 對甘肅隴南、陜西韓城、四川茂縣大紅袍花椒芳香油成分進行對比。

1.2.4 芳香油的體外抑菌實驗

1.2.4.1 供試菌懸液和芳香油供試品溶液的制備 將實驗所用菌種金黃色葡萄球菌、破傷風桿菌、大腸桿菌分別接種于營養培養基(LB)上，在適宜溫度下37 ℃活化12 h,熒光假單胞桿菌在27 ℃活化12 h,最后再用無菌水制備成5 mL/L(1.5×108CFU/mL)的菌懸液,置于4 ℃冰箱中備用。將制得的大紅袍花椒芳香油按照倍比稀釋法,用營養培養基(LB)作為溶劑,將其稀釋成80、40、20、10、5、2.5、1.25 mL/L 7個濃度梯度的溶液。

1.2.4.2 芳香油抑菌活性的測定 采用濾紙片擴散法[10]。用打器將濾紙制作成直徑為6.0 mm的小圓紙片,將小圓片濾紙貼于已涂布5 mL/L菌懸液的LB培養基上,取大紅袍花椒芳香油5 μL滴到每張小圓濾紙片上,用無菌水作為對照,并將其放入37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h。觀察細菌的生長情況并記錄相關數據。測量抑菌圈的直徑,重復3次。

1.2.4.3 芳香油的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定 參照文獻[10]的操作步驟,并稍作修改。將稀釋至一系列濃度梯度的芳香油中加入菌懸液,并將其放入37 ℃的恒溫培養箱中培養12 h,觀察菌體的生長情況,此時的濃度為芳香油的最小抑菌濃度。繼續培養24 h,觀察菌體的生長情況,此時的濃度為芳香油的最小殺菌濃度。重復實驗3次。

1.3 數據處理

運用Origin、SPSS 20軟件對其所得數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 芳香油成分鑒定

運用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)對隴南大紅袍花椒芳香油成分進行分析鑒定,并用色譜峰面積歸一化法測定了各成分的相對百分含量,結果見圖1、表1。

圖1 隴南大紅袍芳香油總離子圖Fig.1 Total ionogram of aromatic oil in Longnan Dahongpao

表1 隴南大紅袍花椒芳香油化學成分及相對含量Table 1 Chemical constituents and relative contents of aromatic oil of Zanthoxylum bungeanum in Longnan Dahongpao

續表

2.2 芳香油成分分析

經過氣相色譜-質譜聯用進行分析,隴南大紅袍芳香油共分離出67個組分,鑒定出50種化學成分,占總量的92.49%,其中萜類化合物的含量最高,芳香族化合物含量次之。在已鑒定的化合物中,相對百分含量在1%以上的有12種,含量占被檢出物質總量的81.83%,其主要的化學成分包括D-檸檬烯(32.08%)、右旋香芹酮(20.02%)、石竹烯(12.26%)、4-萜烯醇(2.92%)、肉豆蔻烯(2.76%)和芳樟醇(2.34%)等,其中含量最高的為D-檸檬烯,高達32.08%。上面八種主要化學成分占總量的76.96%。據最近研究表明,檸檬烯不僅是一種重要的香精香料添加劑,而且還具有抑菌性、防腐保鮮、抗氧化、抗炎癥等多種功效[13]。右旋香芹酮是植物芳香油中重要的抑菌活性成分[14]。其中檸檬烯、石竹烯等均是天然精油中重要的萜烯組分,為可以直接使用的天然食品香料,石竹烯具有抗炎殺菌、局麻、驅蚊蟲、抗抑郁等作用[15]。芳樟醇在花椒芳香油中的含量較高,其有抗菌殺蟲的功效[16]。其中還檢出了少數烷烴,其可能是芳香油本身含有的成分,就其原因還有待進一步研究。

2.3 與陜西韓城、四川茂縣大紅袍花椒芳香油成分的對比

表2 不同地區大紅袍花椒芳香油的主要化學成分的對比Table 2 Comparison of main chemical constituents of Zanthoxylum bungeanum aromatic oil from different regions

注:-表示未檢測出。由表2可知,甘肅隴南、陜西韓城、四川茂縣的大紅袍花椒芳香油中均含有檸檬烯、芳樟醇、β-月桂烯、γ-松油烯、羅勒烯等化學成分,其中檸檬烯的含量在不同地區大紅袍花椒芳香油的含量均為最高,然而甘肅隴南地區的大紅袍花椒芳香油中檸檬烯的含量最高,達到32.08%。在甘肅隴南大紅袍花椒芳香油中含量較高的右旋香芹酮和石竹烯,在陜西韓城和四川茂縣的大紅袍花椒中均未檢測到。芳樟醇、羅勒烯在四川茂縣大紅袍花椒芳香油中含量均最高。而β-月桂烯、γ-松油烯在陜西韓城大紅袍花椒芳香油中含量均最高。芳樟醇在花椒中的含量較高,其有抗菌殺蟲的功效[16]。月桂烯本身可能具有一定的抑菌效果。羅勒烯、月桂烯等成分是花椒香氣的主要來源物質。

2.4 芳香油抑菌效果

2.4.1 芳香油抑菌活性測定 通過對芳香油進行抑菌活性測定,得到圖2、表3。

由表3可知,通過對隴南大紅袍花椒芳香油進行抑菌實驗,4種菌出現了大小不同的抑菌圈。說明了大紅袍花椒芳香油對4種細菌有不同程度的抑菌效果。其抑菌效果很可能與大紅袍花椒揮發油中化學成分含量較高的檸檬烯、右旋在香芹酮、石竹烯和芳樟醇等有關,其具體的作用機制,還有待進一步研究。

表3 隴南大紅袍芳香油的抑菌圈直徑(mm)Table 3 Bacteriostasis circle diameter of aromatic oil from Longnan Dahongpao(mm)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05。

表4 不同濃度的大紅袍花椒芳香油的抑菌作用Table 4 Bacteriostasis of Dahongpao Zanthoxylum bungeanum fragrant oil with different concentrations

注:-表示不長菌,+表示長菌。

表5 不同濃度的大紅袍芳香油的殺菌作用Table 5 Sterilization of Dahongpao aromatic oil with different concentrations

注:-表示不長菌,+表示長菌。

圖2 隴南大紅袍芳香油對4種菌的抑菌效果Fig.2 Antimicrobial effect of aromatic oil from Longnan Dahongpao on four kinds of bacteria注:a:大腸桿菌;b:金黃色葡萄球菌;c:破傷風桿菌;d:熒光假單胞桿菌。

2.4.2 芳香油的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定 通過對芳香油進行等比稀釋,測定其最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC),結果如表4、表5。

由表4、表5可知,大紅袍花椒芳香油對于這4種菌的抑菌效果會隨著其濃度的變化而變化。對于大腸桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為2.5和10 mL/L;對于金黃色葡萄桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為2.5和5 mL/L;對于破傷風桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為5.0和10 mL/L;對于熒光假單胞桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為2.5和5 mL/L。其對于金黃色葡萄球菌和熒光假單胞桿菌的抑菌效果較好。

3 結論與討論

經過氣相色譜-質譜聯用進行分析,隴南大紅袍芳香油共分離出67個組分,鑒定出50種化學成分,占總量的92.49%,其中萜類化合物的含量最高,芳香族化合物含量次之。其主要的化學成分包括D-檸檬烯(32.08%)、右旋香芹酮(20.02%)、石竹烯(12.26%)、4-萜烯醇(2.92%)、肉豆蔻烯(2.76%)等,其中含量最高的為D-檸檬烯,高達32.08%。在甘肅隴南大紅袍花椒芳香油中含量較高的右旋香芹酮和石竹烯在陜西韓城和四川茂縣的大紅袍花椒中均未檢測到,這些不同之處可能與花椒的生長地區有關。目前研究表明,花椒芳香油主要化學成分的種類和含量會因其生長地區和品種的不同而不同[17-21]。在花椒芳香油中含量最高的檸檬烯不僅是一種重要的香精香料添加劑,而且具有抑菌性、防腐保鮮、抗氧化、抗炎癥等多種功效[13]。

通過對隴南大紅袍花椒芳香油進行抑菌性研究,發現其對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、破傷風桿菌、熒光單胞桿菌這四種細菌均具有抑菌性,說明隴南大紅袍花椒芳香油不僅對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和熒光假單胞桿菌)有抑菌效果,而且對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和破傷風桿菌)也有抑菌效果。芳香油的抑菌效果隨著芳香油濃度的變化而變化,因此芳香油的MIC和MBC就至關重要,對于提取開發和生產天然抑菌劑并將其用于醫療行業提供了一定的理論基礎。但是對于芳香油中各種化學成分的協同作用機制和其抑菌活性在生產應用中的實際效果都有待進一步深入研究。