酶法制備阿拉斯加鱈魚降壓肽的工藝優(yōu)化及其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

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(1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003;2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所,山東煙臺(tái) 264003)

目前,心臟與心腦血管疾病,特別是心血管系統(tǒng)疾病中的高血壓是威脅世界各國(guó)人們健康的重要原因。調(diào)查發(fā)現(xiàn),全球高血壓患者已超過(guò)14億人口[1],因此降壓藥物的開發(fā)已成為科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。臨床上常用的抗高血壓藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管緊張素II(AngII)受體拮抗劑。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)可以將無(wú)活性的多肽血管緊張素I(AngI)催化酶解,得到八肽的血管緊張素II(AngII),AngII可以強(qiáng)烈收縮外周小動(dòng)脈,促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的合成以及分泌醛固酮的作用,從而升高血壓[2-3]。

目前,臨床治療高血壓大多采用無(wú)機(jī)、人工合成的ACE抑制劑類藥物,但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生各種副作用。近年來(lái),食源性蛋白肽作為一種新的非合成的ACE抑制劑類藥物,由于其副作用小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[4]受到很多研究者的青睞。人們已經(jīng)從動(dòng)物和植物蛋白的酶解物中獲得了具有降壓活性的肽片段。1986年,Feerreira等[5]首次從南美蝮蛇毒液中提取得到ACE抑制肽。很多研究者也從大豆、麥胚中制備得到ACE抑制肽[6]。相比于陸源生物活性多肽,海洋生物活性多肽更容易釋放出獨(dú)特的活性肽段,產(chǎn)生更好的降壓作用[7]。

阿拉斯加鱈魚為冷水性近底層魚類,魚皮中含有豐富的蛋白質(zhì),較魚體的其他部分蛋白含量更高,但常作為下腳料被丟棄,造成大量水產(chǎn)資源的浪費(fèi)及環(huán)境污染。利用鱈魚加工副產(chǎn)物為原料,采用酶解法制備得到降壓肽,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證阿拉斯加鱈魚降壓肽的ACE抑制活性。為魚皮的高值化綜合利用提供途徑,并為進(jìn)一步開發(fā)新型海洋天然降血壓活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

阿拉斯加鱈魚皮 煙臺(tái)嘉惠海洋生物科技有限公司;堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、胰蛋白酶(250 N.F.U/mg)、酸性蛋白酶(5萬(wàn)U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g)、復(fù)合蛋白酶(10萬(wàn)U/g) 北京索萊寶科技有限公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate,HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 Sigm-aldrich西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;其他試劑 均為分析純或色譜純。

高速離心機(jī)(Avanti JXN-26) 貝克曼庫(kù)爾特有限公司;紫外分光光度計(jì)(Cary 60) 安捷倫科技有限公司;高效液相色譜儀(Agilent1260) 安捷倫科技有限公司;高效液相色譜儀(Waters 1525) 沃特世科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿拉斯加鱈魚皮水提原液的制備 將鱈魚皮清洗干凈,剪成方塊狀(1 cm×1 cm),組織勻漿機(jī)絞碎。加入15%的正丁醇溶液,4 ℃下攪拌8 h進(jìn)行脫脂。濾出溶液,適量去離子水(鱈魚皮體積的3倍)充分?jǐn)嚢枨逑础?.1 mol/L的NaOH溶液4 ℃繼續(xù)攪拌10 h 除去雜蛋白。蒸餾水?dāng)嚢枨逑粗翢o(wú)味。經(jīng)脫脂和除雜蛋白處理后的魚皮中加入適量去離子水(料液比為1∶10),60 ℃水浴中攪拌提取,得到鱈魚皮水提原液。冷凍干燥得到鱈魚皮凍干粉,4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 阿拉斯加鱈魚皮酶解液的制備 稱取72 g阿拉斯加鱈魚皮凍干粉(經(jīng)1.2.1法制備得到),溶于360 mL去離子水(料液比為1∶5),充分混勻,以此溶液作為底物。表1列出了6種蛋白酶的最佳酶解條件。調(diào)節(jié)底物溶液為相應(yīng)蛋白酶的最佳酶解溫度和pH,分別加入3.6 g的酶(酶與底物的質(zhì)量比為5%),酶解3 h后,將6種底物溶液經(jīng)沸水水浴15 min,終止酶解反應(yīng)[8-10]。冷卻至室溫,離心(4000 r/min,15 min,4 ℃),取上清液低溫冷凍干燥得到酶解液凍干粉,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 6種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic conditions of 6 kinds of proteinases

1.2.3 ACE抑制率的檢測(cè) ACE抑制率的檢測(cè)參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行[11-14]。將上述阿拉斯加鱈魚酶解液凍干粉分別溶于適量蒸餾水中,0.5 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)各溶液至相同pH(pH=7)。將ACE和HHL分別溶解在pH8.3,0.1 mol/L的硼酸鈉緩沖溶液(含0.3 mol/L的NaCl),其中NaCl的濃度為0.3 mol/L,ACE溶液的酶活力為0.1 U/mL,HHL溶液的濃度為0.005 mol/L。取20 μL ACE溶液和80 μL上述酶解液凍干粉溶液(對(duì)照組加入等量的硼酸鈉緩沖溶液)于4 mL離心管中混合均勻。在37 ℃環(huán)境下保溫5 min后,向各個(gè)離心管中加入0.005 mol/L HHL溶液170 μL,混合均勻后,在37 ℃環(huán)境下保溫30 min。繼續(xù)向每個(gè)離心管中加入150 μL 1 mol/L的HCl溶液,搖動(dòng)使其混合均勻,終止反應(yīng)。最后向每個(gè)離心管中加入1 mL的乙酸乙酯,漩渦振蕩30 s,離心(4000 r/min,15 min)。靜置5 min,當(dāng)有機(jī)層與水層完全分層后,移取0.8 mL有機(jī)層于5 mL離心管中,將離心管置于80 ℃水浴鍋中揮干乙酸乙酯,最后向殘?jiān)屑尤?.2 mL的去離子水使其充分溶解,測(cè)定該溶液在228 nm處的吸光度值(A228)。

I(%)=(A0-A1)/A0×100

其中:I為ACE抑制率;A0為對(duì)照組的吸光度值;A1為供試品的吸光度值。

1.2.4 胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的工藝條件優(yōu)化

1.2.4.1 pH對(duì)ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標(biāo),在溫度為37 ℃,料液比為1∶5,酶解時(shí)間為180 min,酶與底物質(zhì)量比為5%的條件下研究不同pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)對(duì)ACE抑制肽的影響[15-16]。

1.2.4.2 料液比對(duì)ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標(biāo),在溫度為37 ℃,pH=8.0,酶解時(shí)間為180 min,酶與底物質(zhì)量比為5%的條件下研究不同料液比(1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8)對(duì)ACE抑制肽的影響[17]。

1.2.4.3 溫度對(duì)ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標(biāo),在pH=8.0,酶解應(yīng)時(shí)間為180 min,料液比為1∶7,酶與底物質(zhì)量比為5%的條件下研究不同溫度(30、37、40、50、60 ℃)對(duì)ACE抑制肽的影響[8,18]。

1.2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標(biāo),在料液比為1∶7,pH=8.0,溫度為50 ℃,酶與底物質(zhì)量比為5%的條件下研究不同酶解時(shí)間(90、120、150、180、210 min)對(duì)ACE活性抑制肽的影響[16]。

1.2.4.5 酶與底物質(zhì)量比對(duì)ACE抑制肽的影響 以ACE抑制率為指標(biāo),在料液比為1∶7,pH=8.0,溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為180 min的條件下研究不同酶與底物質(zhì)量(0.5%、2%、3.5%、5%、6%)比對(duì)ACE抑制肽的影響[9]。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L18(37)正交表對(duì)胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,以ACE抑制率為指標(biāo),確定制備阿拉斯加鱈魚降壓肽最佳酶解工藝。如下表3所示為正交試驗(yàn)的水平與因素設(shè)計(jì)[19-20]。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment design

1.2.6 SDS-PAGE分析 采用5%濃縮膠和18%分離膠對(duì)最佳酶解條件下制備的阿拉斯加鱈魚皮酶解液的分子量進(jìn)行測(cè)定[21-22],上樣量為10 μL[23]。

1.2.7 分子量分布考察 對(duì)最優(yōu)酶解工藝下的酶解液采用HPLC法和三重串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分子量分布考察[24]。

HPLC法色譜條件:色譜柱:TSK gel 2000 SWXL300 mm×7.8 mm,流動(dòng)相:乙腈-水-三氟乙酸45∶55∶0.1,等度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm,流速0.5 mL/min,柱溫:30 ℃[25-27]。

質(zhì)譜檢測(cè)條件:進(jìn)樣量10 μL,離子源:ESI,質(zhì)量掃描范圍為100～1400 u,正離子譜檢測(cè)。

1.2.8 氨基酸含量測(cè)定 采用OPA柱前衍生RP-HPLC-UV法對(duì)最佳酶解條件下的酶解液中的17種氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)[28-29]。檢測(cè)條件:色譜柱:ODS柱(5 μm,4.0 mm×250 mm),流動(dòng)相:乙酸鈉-甲醇-乙腈-乙酸鈉-三乙胺-四氫呋喃;梯度洗脫:0～17 min:8% B～50% B;17～20 min:50% B～100% B;20～24 min:100% B～0% B;檢測(cè)波長(zhǎng):338 nm;流速:1 mL/min,柱溫40 ℃[30-31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用酶解法制備得到阿拉斯加鱈魚ACE抑制肽,不同蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的能力不同,因此酶的選擇對(duì)ACE抑制肽的制備至關(guān)重要。下表3為6種不同蛋白酶的酶解效果比較。

由表3可知,6種蛋白酶的酶解物對(duì)ACE均有抑制作用,其中,胰蛋白酶的酶解能力最佳,ACE抑制率為68.48%±2.96%,即胰蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)ACE的抑制活性最佳。因此,胰蛋白酶可作為酶解阿拉斯加鱈魚皮的最適酶種,復(fù)合蛋白酶的活性與菠蘿蛋白酶的活性次之,ACE抑制率分別為63.56%±7.87%和62.70%±4.78%;其他3種蛋白酶的ACE抑制率均小于60%。不同的蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同,6種蛋白酶酶解出來(lái)的肽段的氨基酸組成不同,釋放出來(lái)的肽段序列各異,長(zhǎng)短不一,活性會(huì)有較大差異,對(duì)ACE的抑制率影響也不同。

表3 6種不同蛋白酶的水解效果比較Table 3 Comparison of hydrolysis by 6 kinds of proteinases

注:*:與對(duì)照組(未加酶)比較,差異顯著(P<0.05),**:與對(duì)照組(未加酶)比較,差異極顯著(P<0.01)。

2.2 胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的工藝條件優(yōu)化

2.2.1 pH對(duì)ACE抑制肽的影響 pH對(duì)ACE抑制肽的影響如圖1所示。結(jié)果表明:在pH7.0～9.0的范圍內(nèi),隨著pH的增大,ACE抑制率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),其中pH=7.5時(shí),ACE抑制率最高,為73.19%。分析主要原因是胰蛋白酶在過(guò)堿性條件下,酶的構(gòu)象發(fā)生變化,酶出現(xiàn)了不可逆失活[32]。因此,胰蛋白酶在弱堿性條件下酶解活性較高。

圖1 pH對(duì)ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of different pH on ACE inhibitory rate注:不同字母表示具有顯著性差異,P<0.05;圖2～圖5同。

2.2.2 料液比對(duì)ACE抑制肽的影響 料液比對(duì)ACE抑制肽的影響如圖2所示。結(jié)果表明:在料液比1∶4～1∶7時(shí),隨著料液比的不斷升高,ACE抑制率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶7時(shí),ACE抑制率達(dá)到最大值,為72.87%;當(dāng)料液比由1∶7增加至1∶8時(shí),ACE抑制率略有下降,為72.02%。可能是由于反應(yīng)體系中底物濃度較大,酶活是一定的,隨著料液比進(jìn)一步增大,抑制率變化不明顯[33]。因此,選擇料液比為1∶7最為合適。

圖2 料液比對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on ACE inhibitory rate

2.2.3 酶解溫度對(duì)ACE抑制肽的影響 酶解溫度對(duì)ACE抑制肽的影響如下圖3所示。結(jié)果表明:在30～60 ℃范圍內(nèi),隨著酶解溫度的升高,ACE抑制率也隨之升高。說(shuō)明隨著溫度升高,酶的結(jié)構(gòu)未變化,活性也隨之升高[18]。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),ACE抑制率達(dá)到最大值,為79.26%。且隨著溫度升高,抑制率趨于平穩(wěn),所以50 ℃為優(yōu)選溫度。

圖3 酶解溫度對(duì)ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on ACE inhibitory rate

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制肽的影響 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制肽的影響如圖4所示。結(jié)果表明:隨著酶解時(shí)間的增加,在酶解時(shí)間為90～210 min范圍內(nèi),抑制率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為150 min時(shí),抑制率達(dá)最大值,為75.66%。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間越長(zhǎng),活性肽段的釋放率越高,但隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),一些釋放出的活性肽段會(huì)在蛋白酶的作用下被進(jìn)一步酶解為無(wú)活性的分子,ACE抑制率也會(huì)隨之降低[34]。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on ACE inhibitory rate

2.2.5 酶與底物質(zhì)量比對(duì)ACE抑制肽的影響 酶與底物質(zhì)量比對(duì)ACE抑制肽的影響如圖5所示。結(jié)果表明,在酶與底物質(zhì)量比為0.5%～2%的范圍內(nèi),隨著酶與底物質(zhì)量比的增加,阿拉斯加鱈魚皮蛋白肽被不斷降解成小分子肽段,該反應(yīng)體系的ACE抑制活性隨之增加。當(dāng)酶與底物質(zhì)量比為2%時(shí),抑制率達(dá)最大值,為70.06%。當(dāng)ACE抑制肽被酶飽和后,酶的濃度不再是影響酶解反應(yīng)的主要因素。進(jìn)一步增加酶與底物質(zhì)量比反而降低了活性肽段占蛋白肽的比重,導(dǎo)致酶解速率減慢,ACE抑制率呈下降趨勢(shì)[35]。

圖5 酶與底物質(zhì)量比對(duì)ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of mass ratio of enzyme to substrate on ACE inhibitory rate

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備阿拉斯加鱈魚皮的酶解條件,正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 4 Orthogonal test design and result analysis

由表4可知,各因素影響胰蛋白酶活性大小的順序?yàn)锳>D>C>E>B,即溫度對(duì)胰蛋白酶活性的影響最大,其次為酶與底物質(zhì)量比、料液比、pH,時(shí)間對(duì)其影響最小。

根據(jù)結(jié)果可知,最佳的酶解組合為A1B1C2D3E1,即酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間2 h,料液比1∶7,酶與底物質(zhì)量比3%,pH=7.0時(shí)胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的效果更好,抑制率可達(dá)79.62%。

2.4 SDS-PAGE分析

阿拉斯加鱈魚低聚肽的SDS-PAGE電泳分析如圖6所示。結(jié)果表明,未酶解的阿拉斯加鱈魚皮水體原液的條帶分布不一,經(jīng)酶解的低聚肽溶液未見明顯條帶,需要進(jìn)一步借助高效液相色譜法來(lái)測(cè)定低聚肽酶解液的分子質(zhì)量分布。

圖6 SDS-PAGE電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analysis

2.5 分子量分布考察

相比大分子蛋白質(zhì)和單一的氨基酸,二肽和三肽分子量較小(3～500 kDa),所以更易被人體直接吸收[36],因此分子量分布的考察極為重要。該部分通過(guò)HPLC法對(duì)最優(yōu)酶解條件下的酶解液進(jìn)行了分子量分布考察。從表5(由圖7經(jīng)計(jì)算分析可得)可以看出,分子量低于1000 Da的阿拉斯加鱈魚降壓肽占總體的93.08%,分子量在500 Da以下的占總體的70.74%,平均分子量為457.5 Da。研究發(fā)現(xiàn):最大三肽(Trp-Trp-Trp)和最小二肽(Gly-Gly)的分子量分別為576 u和132 u[37],因此處于這個(gè)區(qū)域之內(nèi)的肽段主要為二肽和三肽。對(duì)最優(yōu)酶解條件下的酶解液進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖8)可以得出與HPLC法相同的結(jié)論:在圖譜中可見質(zhì)子峰多集中的m/z范圍為200～500。這說(shuō)明在最佳酶解條件下,阿拉斯加鱈魚皮酶解得到了以二肽和三肽為主的降壓肽。譜圖中含有多種不同信號(hào)強(qiáng)度的質(zhì)子峰,這說(shuō)明最佳酶解條件的酶解液是含有多種不同分子量的多肽混合物。

圖7 阿拉斯加鱈魚低聚肽酶解液的液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of enzymatic hydrolysate注:圖中數(shù)值代表Mp值(最高位峰的分子量)。

分子量范圍(Da)保留時(shí)間(min)峰面積百分比(%,λ220nm)>200015.0401.282000～100016.5035.641000～50017.67122.34500～18019.14748.19<18019.78322.55

圖8 阿拉斯加鱈魚低聚肽酶解液的質(zhì)譜圖Fig.8 MS spectrum of enzymatic hydrolysate

2.6 酶解液氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)最優(yōu)酶解工藝條件下的酶解液進(jìn)行氨基酸含量測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如表6所示。阿拉斯加鱈魚皮酶解液中氨基酸總含量約為83%,其中Gly含量最高,為29.41%,Pro含量次之,可達(dá)16.11%;人體必需氨基酸約占氨基酸總含量的18.9%。相比牡蠣ACE抑制肽,鱈魚皮降壓肽中氨基酸總含量更高[35]。與從羅非魚魚鱗膠降壓肽的氨基酸組成幾乎相同,但鱈魚皮降壓肽中Gly和Pro含量更高[38]。其中,在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,Gly是最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。甘氨酸通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,減輕大鼠的腦出血損傷[39]。脯氨酸是體內(nèi)合成蛋白質(zhì)的氨基酸之一,為細(xì)胞新陳代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[40]。降壓肽中脯氨酸的含量較高會(huì)對(duì)多肽的ACE抑制作用起到很好的促進(jìn)作用[38]。

表6 酶解液的氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of enzymatic hydrolysate

注:表中標(biāo)注*為必需氨基酸。

3 結(jié)論

本研究以ACE抑制率為指標(biāo),比較了6 種蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮的能力。通過(guò)工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝為:胰蛋白酶酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間2 h,料液比1∶7,酶與底物質(zhì)量比3%,pH=7。最優(yōu)工藝的酶解液ACE抑制率為79.62%。分子量在500 Da以下的占總體的70.74%;酶解液氨基酸總含量為83%,其中Gly含量最高,為29.41%,Pro含量次之,可達(dá)16.11%;酶解液中含有7種必需氨基酸,分別是Ile、Leu、Met、Val、Phe、Lys、Thr。阿拉斯加鱈魚皮酶解液在體外研究中具有很好的ACE抑制活性,未來(lái)在功能性食品的開發(fā)應(yīng)用中將具有很高的研究?jī)r(jià)值。