玉米芯多糖的微生物發酵工藝及其單糖組成和體外益生活性研究

劉玉輝,王瑞芳,安曉萍,王 園,劉 娜,楊艷平,齊景偉

(內蒙古農業大學動物科學學院,內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心,內蒙古呼和浩特 010018)

我國是農業大國,玉米是我國最主要的農作物之一,與小麥、水稻并稱為我國三大糧食作物,其年產量可達2億多噸。玉米芯是玉米穗脫粒后的穗軸,屬于玉米的副產物,其年產量可達4000萬噸[1],主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。在工業上,玉米芯主要作為生產糠醛和木糖醇的原料[2],而在畜牧業上,由于其適口性差,且營養物質不易消化吸收,因此應用較少[3]。大部分玉木芯被直接作為燃料焚燒,或被丟棄,造成資源浪費、環境污染,因此對玉米芯進行深度開發利用具有極其重要的意義。

多糖是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接到一起的大分子聚合物,在生物體內廣泛存在,尤其是在植物體內。大量研究發現,植物多糖參與機體各種生命活動,具有多種生物學功能,如抗腫瘤、消炎殺菌、降血壓、調節機體免疫力等[4]。研究證實玉米芯多糖具有抗凝血[5-6]、抗氧化和抗菌活性等生物作用,具有較大的研究和開發價值[7]。玉米芯中有大量的粗纖維(54.5%),能被提取出來的多糖很少,很多研究發現對玉米芯進行處理,可以增加玉米芯多糖的提取率,如丁存寶等[8]利用響應面優化超聲波輔助法提取玉米芯中多糖,顯示經超聲波輔助處理后玉米芯多糖提取率可達7.19%,含量達到71.9 mg/g。已報道的玉米芯中多糖或木聚糖的提取方法有酸提法[9]、堿提法[10]、雙氧水預處理法[11]、超聲波輔助法[8]和菌酶協同發酵法[12],采用微生物發酵技術能夠利用微生物的發酵作用,破壞植物細胞壁結構,使植物細胞壁中的多糖及其它生物活性物質較大程度的同步溶出,從而提高其產量及生物活性。

本實驗室前期研究發現通過微生物發酵處理后麩皮[13-14]和玉米芯[12]中多糖含量明顯升高,且發酵后的多糖具有較高的抗炎和抗氧化活性。因此,本研究擬在前期實驗基礎上研究發酵菌種、輔料種類、纖維素酶、料液比、發酵溫度及發酵時間對玉米芯中多糖含量的影響,獲得最佳發酵工藝;同時分析發酵與未發酵玉米芯中提取多糖的單糖組成,并評價其體外益生活性,研究玉米芯多糖組分與其活性的關系,本實驗研究結果將為提高玉米芯多糖的提取效率和深度開發利用玉米芯資源提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米芯 購買于市場,干燥粉碎過40目篩;枯草芽孢桿菌CGMCC 1.892(BacillussubtilisCGMCC 1.892)、釀酒酵母CGMCC 2.119(SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.119)、植物乳桿菌CGMCC1.2437(LactobacillusplantarumCGMCC1.2437)和嗜熱鏈球菌CGMCC 1.2471(StreptococcusthermophilesCGMCC 1.2471) 中國微生物菌種保藏中心;營養肉湯培養基、麥芽汁培養基、MRS肉湯培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、巖藻糖、D-核糖 分析純,美國Sigma;濃硫酸、苯酚、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇 天津市匯杭化工科技有限公司。

SW-CJ超凈工作臺 上海新苗醫療器械;GX2型智力光照培養箱 寧波東南儀器有限公司;QYC-200恒溫培養搖床 上海福瑪實驗設備有限公司;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司;微孔板分光光度計 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

1.2.1.1 釀酒酵母菌懸液制備 將甘油冷凍保存的釀酒酵母菌接種到麥芽汁瓊脂固體培養基,37 ℃活化48 h,挑選一株生長良好且形狀規則的釀酒酵母菌落接種到麥芽汁液體培養基中,接菌量為5%,放在28 ℃,120 r/min的搖床中培養24 h進行復壯,從中吸取菌懸液到新的麥芽汁液體培養基中,放在28 ℃、120 r/min的搖床中培養24 h,再吸取菌懸液到新的麥芽汁液體培養基中相同條件下進行培養24 h,重復一次,此時菌懸液菌體濃度為108cfu/mL[11]。

1.2.1.2 枯草芽孢桿菌菌懸液制備 將甘油冷凍保存的枯草芽孢桿菌接種到營養肉湯瓊脂固體培養基,37 ℃活化24 h,挑選一株生長良好形狀規則的枯草芽孢桿菌落,接種到營養肉湯液體培養基中,放在36 ℃、120 r/min的搖床中培養24 h進行復壯,從中吸取菌懸液到新的營養肉湯液體培養基中,放在36 ℃、120 r/min的搖床中培養24 h,再吸取菌懸液到新的營養肉湯液體培養基中進行培養24 h,重復一次此時菌懸液菌體濃度為108cfu/mL[11]。

1.2.2 發酵條件的篩選

1.2.2.1 發酵菌種對玉米芯多糖含量的影響 將添加10%麩皮的玉米芯滅菌后分別接種8%釀酒酵母菌懸液、8%芽孢枯草桿菌菌懸液及4%釀酒酵母菌懸液+4%芽孢枯草桿菌菌懸液混合進行發酵處理,料水比1∶1.5 (g/mL),發酵溫度35 ℃,發酵時間96 h,烘干粉碎用于多糖提取及含量測定,以多糖含量作為評價指標篩選最優發酵菌種。

1.2.2.2 輔料種類對玉米芯多糖含量的影響 在玉米芯中分別添加10%的豆粕、10%的麩皮及5%豆粕+5%麩皮,混合均勻后滅菌,接種8%芽孢枯草桿菌菌懸液,料水比1∶1.5 (g/mL),發酵溫度35 ℃,發酵時間96 h,烘干粉碎用于多糖提取及含量測定,以多糖含量作為評價指標篩選最佳輔料種類。

1.2.2.3 纖維素酶添加量對玉米芯多糖含量的影響 在玉米芯中加入10%麩皮混勻滅菌,再分別加入0(空白對照組)、500、1000、1500和2000 U/g的纖維素酶,接種8%芽孢枯草桿菌菌懸液,料水比1∶1.5 (g/mL),發酵溫度35 ℃,發酵時間96 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量測定,以多糖含量作為評價指標篩選最適纖維素酶添加量。

1.2.2.4 發酵料水比對玉米芯多糖含量的影響 在玉米芯中加入10%麩皮混勻滅菌,加500 U/g的纖維素酶,接種8%芽孢枯草桿菌菌懸液,料水比分別為1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶1.75 (g/mL),發酵溫度35 ℃,發酵時間96 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量測定,以多糖含量作為評價指標篩選最適料水比。

1.2.2.5 發酵時間對玉米芯多糖含量的影響 在玉米芯中加入10%麩皮混勻滅菌,添加500 U/g的纖維素酶,接種8%芽孢枯草桿菌菌懸液,料水比為1∶1.25 (g/mL),發酵溫度分別為35 ℃,分別發酵0、48、72、96、120 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量測定,以多糖含量作為評價指標篩選最適發酵時間。

1.2.2.6 發酵溫度對玉米芯多糖含量的影響 在玉米芯中加入10%麩皮混勻滅菌,添加500 U/g的纖維素酶,接種8%芽孢枯草桿菌菌懸液,料水比為1∶1.25 (g/mL),發酵溫度分別為33、35、37、39 ℃,發酵時間96 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量測定,以多糖含量作為評價指標篩選最適發酵溫度。

1.2.3 玉米芯多糖的提取 發酵后的玉米芯于45 ℃烘箱中烘干,粉碎,稱取1 g料添加20 mL蒸餾水,于80 ℃水浴鍋中熱水浸提40 min,取出后流水冷卻,5000 r/min,離心15 min,棄沉淀,留上清待測[15]。

1.2.4 多糖含量的測定(苯酚-硫酸法) 以葡萄糖為標準品,采用苯酚硫酸法測定多糖含量[16],具體測定步驟為取1 mL稀釋適宜倍數的玉米芯上清液,加入1 mL蒸餾水,再加入1 mL 6%苯酚溶液,然后加5 mL濃硫酸混勻,室溫冷卻20 min后,取200 μL加入到96孔酶標板中,使用酶標儀在490 nm下測定吸光度值。根據標準曲線計算多糖含量,標準曲線回歸方程為y=0.3099x-0.0091,y代表糖的濃度(mg/mL),x代表吸光度值,相關系數R2=0.9989。

玉米芯多糖含量計算公式:

式中:A代表玉米芯多糖含量,mg/g;c代表稀釋液多糖濃度,mg/mL;D代表稀釋倍數;V代表上清液體積,mL;m代表玉米芯質量,g。

1.2.5 Sevage法去蛋白及醇沉粗多糖方法 在40 g/L的多糖溶液中按照其體積的0.2%加入中性蛋白酶,攪拌后40 ℃酶解1.5 h(用自封袋封口),沸水浴10 min使酶失活,冷卻后5000 r/min,離心10 min。取上清液與sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇4∶1)按照體積比3∶1混合[17],使用磁力攪拌器充分攪拌30 min,之后5000 r/min,離心15 min,取上清再按體積比3∶1加入Sevage試劑重復上述步驟兩次,以去除多糖溶液中殘留的蛋白質。

將去蛋白后的多糖溶液放入旋轉蒸發儀中蒸發濃縮,濃縮后的多糖溶液用80%的乙醇沉淀12 h,5000 r/min,離心10 min,棄上清,留沉淀,冷凍干燥48 h后備用。

1.2.6 玉米芯粗多糖的單糖組成分析 分別稱取發酵和未發酵的玉米芯醇沉后粗多糖2 mg,加入0.5 mL濃度為2 mol/L三氟乙酸,120 ℃水解120 min,使用氮吹儀吹干。用單糖標準品配制成10 mg/mL溶液,取5 μL各個單糖標品溶液,加入0.5 mL濃度為2 mol/L三氟乙酸中,與樣品同時在120 ℃下水解120 min,并使用氮吹儀吹干。向吹干后得到的樣品中加入0.5 mL甲醇溶液(0.5 mol/L)和0.5 mL NaOH溶液(0.3 mol/L),混勻后在70 ℃水浴條件下反應30 min。冷卻至室溫,加入0.3 mol/L 鹽酸0.5 mL中和。用0.5 mL氯仿反復萃取3次,5000 r/min離心5 min,取上清液,經0.22 μm 微孔濾膜過濾后待HPLC分析。

HPLC條件:SHISEIDO C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0);流動相B為乙腈水溶液(82∶18,v/v);流速為1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量10 μL;采用VWD測器在245 nm處檢測[18]。

1.2.7 發酵玉米芯粗多糖的益生活性評價 將甘油冷凍保存的植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌菌種接種到MRS肉湯瓊脂固體培養基37 ℃活化48 h,挑選一株生長良好且形狀規則的菌落,接種到MRS肉湯液體培養基中,36 ℃、靜置厭氧培養24 h,取菌懸液備用。實驗以無碳水化合物的MRS培養基作為基礎培養基,設置三個處理組,分別為在基礎培養基中添加a:20 mg/mL的葡萄糖,b:10 mg/mL葡萄糖和10 mg/mL的發酵玉米芯醇沉粗多糖混合,c:10 mg/mL葡萄糖和10 mg/mL的未發酵玉米芯醇沉粗多糖混合。所有培養基均121 ℃滅菌20 min,冷卻后分別接種1%植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌菌懸液,36 ℃靜置厭氧培養,每隔2 h在600 nm處測定培養基的OD值,以相對0 h處OD值的增長量繪制不同處理組中植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長曲線。

1.3 數據處理

實驗所有數據均用平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用 SAS 9.2 統計軟件進行ANOVA單因素方差分析,并用Duncan’s法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種對玉米芯多糖含量的影響

如圖1所示,接種8%枯草芽孢桿菌組玉米芯中多糖含量顯著高于其他三個處理組(P<0.05),且4%釀酒酵母+4%枯草芽孢桿菌聯合發酵組玉米芯中多糖含量顯著高于接種8%釀酒酵母組(P<0.05),但與未加菌組相比無顯著差異(P>0.05)。由上述實驗結果可知,枯草芽孢桿菌是玉米芯發酵的最適菌種,可顯著提高玉米芯中多糖的含量(P<0.05),這可能是由于枯草芽孢桿菌在進行生理活動過程中代謝產生的多種酶類如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等[19]對玉米芯產生降解作用,使得玉米芯多糖含量增加。因此,后期實驗中通過接種8%的枯草芽孢桿菌進行玉米芯發酵。

圖1 發酵菌種對玉米芯多糖含量的影響Fig.1 Effects of fermentation strains on polysaccharide contents of corn cob 注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖7同。

2.2 添加不同輔料對發酵玉米芯中多糖含量的影響

如圖2所示,與無輔料添加組相比,玉米芯中添加10%麩皮作為輔料進行發酵顯著提高了玉米芯中多糖的含量(P<0.05),而添加10%豆粕組與添加5%豆粕和5%麩皮組玉米芯中多糖含量無顯著提高(P>0.05)。由上述實驗結果可知,添加10%麩皮作為輔料進行玉米芯發酵可使多糖含量顯著提高(P<0.05),這可能是麩皮的營養價值更加豐富[20],一定程度上可改善發酵體系中的碳氮比例,從而促進微生物的生長及對玉米芯的發酵利用,使得玉米芯多糖的含量增加。因此,后期實驗中選擇在玉米芯中添加10%麩皮以改善發酵環境,提高玉米芯中多糖含量。

圖2 輔料種類對玉米芯多糖含量的影響Fig.2 Effects of auxiliary materials varieties on polysaccharide contents of corn cob

2.3 纖維素酶添加量對發酵玉米芯多糖含量的影響

如圖3所示,發酵前添加纖維素酶可顯著提高發酵后玉米芯多糖的含量(P<0.05),隨纖維素酶添加量的增加,發酵后玉米芯多糖含量顯著升高(P<0.05),在酶添加量達到1000 U/g后達到穩定,其中添加1000 U/g纖維素酶時發酵玉米芯中多糖含量最高,但與500、1500和2000 U/g組相比無顯著差異(P>0.05)。由上述實驗結果可知,玉米芯發酵前添加一定量的纖維素酶進行預處理可顯著改善玉米芯的發酵效果(P<0.05),這一結果與陸步詩等[21]對酶法降解玉米芯生產低醇飲料的研究結果相似,該研究中也發現添加一定量的纖維素酶可提高玉米芯中還原糖的含量,但玉米芯多糖含量與纖維素酶添加量間并不是線性增加關系,考慮到纖維素酶的成本,后期實驗中選擇添加500 U/g的纖維素酶進行玉米芯發酵。

圖3 纖維素酶添加量對玉米芯多糖含量的影響Fig.3 Effects of cellulase addition on polysaccharide contents of corn cob

2.4 料水比對發酵玉米芯多糖含量的影響

如圖4所示,玉米芯多糖含量在料水比為1∶1、1∶1.25和1∶1.5(g/mL)組無顯著差異(P>0.05),當料水比增加到1∶1.75時玉米芯多糖含量顯著低于料水比為1∶1.25和1∶1.5 (g/mL)組(P<0.05),考慮成本,后期實驗中選擇料水比1∶1.25 (g/mL)為最佳料水比進行玉米芯發酵。

圖4 料水比對玉米芯多糖含量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide contents of corn cob

2.5 發酵時間對玉米芯多糖含量的影響

如圖5所示,玉米芯多糖含量在發酵后48 h略降低,之后隨著發酵時間的延長逐漸增加,在96 h后趨于穩定,其中發酵后72、96和120 h時多糖含量顯著高于48h時多糖的含量(P<0.05),且發酵后96和120 h多糖含量顯著高于發酵前玉米芯多糖含量(P<0.05)。發酵后48 h玉米芯多糖含量降低可能是:在發酵初期為維持生長益生菌將玉米芯中多糖作為碳源進行消耗,從而導致多糖含量降低,但隨著發酵時間的延長,細菌代謝產生多糖,因此,玉米芯多糖含量增加并趨于穩定。基于以上實驗結果,后期實驗選擇發酵時間為96 h做為最佳發酵時間。

圖5 發酵時間對玉米芯多糖含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on polysaccharide contents of corn cob

2.6 發酵溫度對玉米芯多糖含量的影響

如圖6所示,各發酵溫度玉米芯多糖含量差異不顯著(P>0.05),但隨著發酵溫度升高玉米芯多糖含量先升高后降低,且在35 ℃條件下多糖含量最高為162.61 mg/g，同等條件下測定未發酵玉米芯多糖含量為135.33 mg/g，玉米芯多糖含量提高了20.16%。因此,后期實驗選擇35 ℃作為發酵玉米芯制備多糖的最優發酵溫度。

圖6 發酵溫度對玉米芯多糖含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on polysaccharide contents of corn cob

2.7 發酵與未發酵玉米芯多糖的單糖組成分析

由表1可知,未發酵組與發酵玉米芯去蛋白醇沉后其多糖均由木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、巖藻糖和核糖組成。其中未發酵組玉米芯多糖主要由木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成,其摩爾百分比分別是29.44%、19.71%、16.49%、15.71%、15.16%;發酵組玉米芯多糖主要由木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖組成,其摩爾百分比分別是40.68%、23.56%、14.88%、11.32%,這一結果與胡妍[22]和Yu等[23]研究結果相似,這些研究中均發現玉米芯可溶性糖中木糖、阿拉伯糖含量最高。在本研究中,與未發酵組相比,發酵后玉米芯多糖含量提高了77.34%,木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的含量提高,而葡萄糖含量降低了57.29%。發酵后主要單糖含量的提高可能是在微生物發酵的作用下,玉米芯本身含有的葡萄糖和其他含碳物質被微生物代謝利用產生為其他種類的單糖。

表1 發酵與未發酵玉米芯粗多糖的單糖組成Table 1 The monosaccharide composition of fermented and unfermented corn cob polysaccharide

2.8 發酵與未發酵玉米芯粗多糖益生活性評價

圖7 玉米芯粗多糖對植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長影響Fig.7 Effect of crude corn cobpolysaccharide on proliferation of Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermophiles注:A為玉米芯粗多糖對植物乳桿菌生長影響, B為玉米芯粗多糖對嗜熱鏈球菌生長影響。

如圖7所示,由玉米芯粗多糖對植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌體外益生實驗可知,三個處理組菌液OD值均隨著培養時間的延長而增加,表明添加20 mg/mL葡萄糖和10 mg/mL葡萄糖+10 mg/mL的發酵或未發酵玉米芯粗多糖對植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長均具有促進作用;在0～6 h添加玉米芯粗多糖組對植物乳桿菌增殖的促進作用顯著優于僅添加葡萄糖組(P<0.05),而在8 h后20 mg/mL葡萄糖對植物乳桿菌的促生長作用更為顯著(P<0.05)(圖7A)。添加發酵玉米芯粗多糖或未發酵玉米芯粗多糖對嗜熱鏈球菌的促生長作用在整個生長過程均顯著優于僅添加葡萄糖組(P<0.05)(圖7B)。植物多糖的益生作用已被廣泛報道,Bashirat等[24]研究發現棕櫚仁餅多糖對兩種植物乳桿菌有良好的益生活性。Jayamanohar等[25]對紅蕓豆水提多糖的益生元活力進行研究,發現紅蕓豆多糖對植物乳桿菌生長有明顯的促進作用。Wang等[26]研究菜籽粗多糖的體外益生活性,發現菜籽粗多糖可以明顯的促進三種雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖。余茂元等[27]對霍山石斛多糖的分離純化及其益生作用的研究,結果發現,在等量碳源下,添加一定量的霍山石斛多糖可以作為益生元,刺激菌體的活性,加快了自身的生長繁殖,本試驗結果與其相同。

比較發酵與未發酵玉米芯粗多糖對植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響,可見除6和8 h兩個時間點外,在其余時間點添加發酵粗多糖組對植物乳桿菌的促增殖作用均顯著強于未發酵粗多糖組(P<0.05)(圖7A)。添加發酵玉米芯粗多糖組對嗜熱鏈球菌的促生長作用在2 h后均顯著優于添加未發酵玉米芯粗多糖組(P<0.05)(圖7B)。發酵后玉米芯粗多糖的益生作用增強可能是由于玉米芯中木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖這些益生元物質在發酵后增加從而促進了菌體的生長。

3 結論

本研究以發酵玉米芯多糖含量為評價指標,對發酵菌種、輔料種類、纖維素酶添加量、料水比、發酵時間及發酵溫度進行篩選,最終確定玉米芯發酵工藝為:使用8%的枯草芽孢桿菌進行玉米芯發酵并添加10%麩皮作為輔料,同時發酵前添加500 U/g纖維素酶進行酶菌協同發酵,最適發酵料水比為1∶1.25 (g/mL),發酵時間為96 h,發酵溫度為35 ℃,在此條件下玉米芯多糖含量可達到162.61 mg/g。

通過研究玉米芯多糖的體外益生活性,發現培養基中添加玉米芯多糖可顯著促進植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長速度(P<0.05),具有很好的益生作用。根據單糖組成結果分析,玉米芯經過發酵后木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖均有明顯的提高,因此,推測經過發酵處理后玉米芯粗多糖對植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的促生長作用可能與玉米芯中木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖這些益生元物質的增加有關。