循環伏安法檢測辣椒中辣椒堿條件優化

(南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心,江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

原產墨西哥的辣椒(Capsicumspp.)是深受世人青睞且種植多、使用廣、產消較大的調味作物,其主要辣味物質為辣椒堿[1],辣椒堿含量是衡量和鑒定辣椒品質的關鍵指標。我國是世界上最大的辣椒生產、消費和出口國,近3年辣椒出口量增長25%以上,貿易量占全球的20%以上[2]。辣椒堿具有優異的抗氧化[3-4]、抗菌[5]和抗癌[6]等生物學活性,良好的測定方法也將有助于對具有不同含量辣椒堿的原料進行初步鑒定。因此,尋求一種能快速簡便地檢測辣椒堿的方法便具有一定的意義。

對于辣椒堿的檢測,現有的色譜法和質譜法存在測定成本高和耗時等問題[7-8],光譜法則存在選擇性和準確度不高等問題[9],相比之下電化學法具有快速便捷和成本低廉等優點[10-11],能夠準確安全地測定辣椒堿。依據循環伏安法的正(反)向掃描的氧化(還原)峰電流ipk(ipa)的圖形特征和峰值大小,可判斷此氧化(還原)電對的特性及其相對含量。Manaia等[12]研究表明辣椒堿在正向掃描時,其苯環上的酚羥基易失去電子而生成氧化態(醌),且其氧化特征峰ipk大小與反應體系中辣椒堿含量成正相關,據此可通過測得其ipk值求得測定體系中辣椒堿含量[13]。但該研究只對辣椒堿在各種電化學方法上的行為進行了定性研究,并未對循環伏安法定量測定辣椒堿進行詳細分析和優化。此外,采用納米粒子修飾工作電極將有助于提升對辣椒堿的選擇性和靈敏性,但修飾物的成本均較高[14-15]。

本文首先采用自制β-環糊精碳糊電極和玻碳電極對辣椒堿純品進行了循環伏安掃描,在比較峰型和靈敏度后,選擇檢測性能較好的β-環糊精修飾碳糊電極作為本研究的工作電極,依次考察了不同緩沖體系、電壓掃描速率、體系離子強度、電解質種類、溫度和干擾物質對測定的影響。在確定相關最佳條件后,得出了最佳條件下的標準工作曲線和檢出限,并考察了方法的精密度、實樣和加標回收率,旨在為以電化學法快速簡便測定辣椒堿技術提供支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

越南小米辣、貴州燈籠椒 明氏誠信辣業店;印度魔鬼椒、河南小椒 小兩口干貨特產店;江西甜椒 好美優品店提供;山東小米 辣沂蒙農家味道店;以上共6個品種的10個干鮮辣椒試樣分兩個批次購得;辣椒堿、辣椒色素 AR,西安維珍生物科技有限公司;維生素C、葡萄糖等其他試劑 AR,國藥試劑公司產;測定用水 自制超純水。

MetrohmAutolab PGSTAT101(配NOVA 2.1.3數據處理軟件)電化學工作站 瑞士萬通公司;玻碳電極、銅電極、鉑絲電極、銀/氯化銀(Ag/AgCl)參比電極 天津艾達恒晟科技有限公司;232-01型甘汞參比電極 上海儀電科學儀器股份有限公司;XW-80A旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;202-00BS真空干燥箱 上海力辰科技有限公司;ME204T/02電子分析天平 梅特勒-托利多國際有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預處理 將購買的辣椒樣品除蒂除雜后,計量并在55 ℃真空干燥箱中烘干4～8 h,粉碎過60目篩,計量、裝瓶備用。取粉碎好的試樣按文獻[16]的方法以料液比1∶20 (m/V)加入無水乙醇于超聲功率200 W、頻率40 Hz和50 ℃下連續提取1.5 h;提取液趁熱用3#砂芯濾器迅速抽濾,冷卻后裝瓶于4 ℃冰箱內保存備用。

1.2.2 采用循環伏安法測定辣椒堿 用無水乙醇配得的辣椒堿標準溶液(1.0×10-4～1.0 mmol/L),在合適的支撐溶液和緩沖溶液體系中,以飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為輔助電極和玻碳電極或自制改良修飾碳糊電極為工作電極的三電極工作體系于電化學工作站上在一定的掃描電壓、掃描速率下進行循環伏安模式的掃描,測定相應的標準工作曲線。然后取一定量的試樣備用液,按此法測得試樣中辣椒堿的含量。

1.2.3 測定條件的選擇

1.2.3.1 電極的選擇 在底液KCl 0.10 mol/L,辣椒堿2.50 mmol/L,Britton-Robison緩沖體系,pH11,20 ℃,掃描電壓速率100 mV/s條件下,經比較測量電極的特性和適用性[17-21]并結合實情,以飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為輔助電極,通過自制修飾碳糊電極與玻碳電極的比對試驗確定適宜工作電極。

修飾碳糊電極的自制方法:在文獻[17-19]的基礎上針對實驗特點做改良,即處理好的石墨粉∶β-環糊精=10∶1 (m/m)組成混合粉末,再按1.5 g/mL的比例加入液體石蠟后于旋渦混合儀混合5～8 min(邊加邊混合)得均勻糊狀物,并緩慢注入特制聚四氟乙烯管中(用真空法以確保其無氣泡),蓋上油紙壓實,用膜將電極表面打磨至有明顯金屬光澤即成。

1.2.3.2 緩沖溶液體系及其pH的選定 在調研的基礎上[10-11],以β-環糊精修飾碳糊電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為輔助電極,底液KCl 0.10 mol/L,辣椒堿2.50 mmol/L,掃描電壓速率100 mV/s,20 ℃條件下,對磷酸鉀-磷酸氫二鉀(K3PO4-K2HPO4)、磷酸鈉-磷酸氫二鈉(Na3PO4-Na2HPO4)、碳酸鉀-碳酸氫鉀(K2CO3-KHCO3)、硼砂緩沖液和Britton-Robison緩沖液的比較,尋得適宜緩沖溶液體系及pH值。

1.2.3.3 其它因素測定條件的選定方法 在β-環糊精修飾碳糊電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為輔助電極,辣椒堿2.50 mmol/L,Britton-Robison緩沖體系pH11下,采取單因素法分別對電壓掃描速率、調節劑種類、測量體系離子強度和溫度等4個因素進行試驗,通過測得其工作電流與掃描電壓(i～V)曲線的圖形和ipk值來確定測定的適宜條件。

1.2.3.4 選擇性試驗的方法 為消除測定體系干擾物的影響,以循環伏安掃描圖的特征峰及峰形特征來判斷其影響,并根據所測辣椒試樣中可能存在的干擾物質為維生素C、葡萄糖和辣椒色素,所以選擇性試驗方法為:在所得的適宜條件下,采用添加試樣中存在的維生素C、葡萄糖和辣椒色素的1～20倍量進行測試。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 標準工作曲線和檢測限的測定 在適宜條件下,取辣椒堿標液(ccp)分別為10.0、1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4mmol/L,測得其i～V曲線及ipk值。依此得到辣椒堿測量的標準曲線,根據其斜率(k)和空白值測定的標準偏差(Sb)求得其檢測限(LODs=3Sb/k)[22]。

1.2.4.2 方法精密度和準確度的測定 方法的精密度以相對標準偏差(RSD)表示。方法準確度用加標實驗的回收率和RSD以及與高效液相色譜法(HPLC)[7,23]測定結果的比較來共同表示。

1.2.5 實際樣品的測定 在適宜條件下,按1.2.1制得的10個樣液分別用循環伏安法和HPLC法測定。

1.3 數據處理

經Nova 2.3.1測得的循環伏安數據,用Excel 2017繪圖,用SPSS 19.0做統計處理,且結果以“平均值±SD”表示。

2 結果與分析

2.1 工作電極的確定

按1.2.3.1方法在只改變工作電極下,所得結果見圖1。

圖1 玻碳電極和β-環糊精修飾碳糊電極的比較Fig.1 Comparison of glassy carbon electrode and carbon paste electrode modified by β-cyclodextrin

由圖1知,玻碳電極的氧化峰不很明顯,與β-環糊精修飾碳糊電極相比,對辣椒堿的靈敏度較低,而β-環糊精修飾碳糊電極測得的氧化峰十分突出,且峰形頗好,故選β-環糊精修飾碳糊電極做工作電極。

2.2 緩沖溶液體系及其酸度對ipk的影響

按1.2.3.2方法在pH11條件下,僅改變緩沖體系,測得結果見表1。

由表1知,在考察的5種緩沖溶液中以Britton-Robison緩沖體系的ipk最大,且RSD=1.1%,表明Britton-Robison緩沖體系很適合本測定方法及其體系。因此,選取Britton-Robison緩沖體系為佳。

表1 緩沖溶液體系對ipk的影響(n=3)Table 1 Influence of buffer systems on ipk(n=3)

按1.2.3.2方法在Britton-Robison緩沖體系下,僅改變體系pH,測得峰電流結果見圖2。

圖2 pH與ipk的線性關系Fig.2 Linear correlations between pH with ipk

由圖2知,體系pH與ipk間呈強正相關(ipk=0.9673pH-1.7997,R2=0.9835),且當pH11時,ipk最大,反應易發生程度和測定靈敏度都最佳,故選擇緩沖溶液體系的酸度為pH11。

2.3 電壓掃描速率對ipk的影響

按1.2.3.3方法在底液KCl 0.10 mol/L,20 ℃下,僅改變掃描電壓速率,所得結果見圖3和圖4。

圖3 不同掃描速率下工作電流的變化Fig.3 Changes of working current under different scan rates

圖4 掃描速率與ipk的線性關系Fig.4 Linear correlations between scan rate with ipk

圖3反映出電壓掃描速率越高ipk值越大,但掃描速率≥200 mV/s時,會出現電極表面迅速沉積而使循環伏安曲線重現性破壞。雖然當電壓掃描速率100 mV/s時,其ipk值不是最大,但它有良好氧化峰形(如圖3)和頗佳的重現性(RSD≤1.1%),且單次循環掃描時間也短。因此,電壓掃描速率以選100 mV/s為宜。另外,由圖4得知,電壓掃描速率(v)與ipk間線性關系良好(當v=0～50 mV/s時,線性方程為ipk=0.0971v+0.9084,R2=0.9882;當v=50～500 mV/s時,線性方程為ipk=0.0486v+3.5634,R2=0.9958;且高掃描速率下的線性更好些)。

2.4 體系離子強度對ipk的影響

按1.2.3.3方法在掃描電壓速率100 mV/s、20 ℃,僅改變體系離子強度下,所得結果見表2。

表2 離子強度對ipk的影響(n=3)Table 2 Influence of ionic strength on ipk(n=3)

由表2知,當體系離子強度(IS)為0.20 mol/L(調節劑KCl濃度為0.10 mol/L)時,ipk最大,表明此時電極反應極易發生。因此,取IS=0.20 mol/L(調節劑KCl為0.10 mol/L)為宜。

2.5 電解質種類對ipk的影響

按1.2.3.3方法在IS=0.20 mol/L,掃描電壓速率100 mV/s,20 ℃,只改變體系電解質種類下,測得結果見表3。

表3 電解質種類對ipk的影響(n=3)Table 3 Influence of electrolyte species on ipk(n=3)

由表3知,在相同離子強度下,以調節劑KCl組的ipk最大,反應的進行和達到平衡都更易。故選用KCl作離子強度調節劑為佳。

2.6 測定溫度對ipk的影響

按1.2.3.3方法在底液KCl 0.10 mol/L,掃描電壓速率100 mV/s,20 ℃,只改變體系溫度下,測得結果見表4。

表4 測定溫度對ipk和Epk的影響(n=3)Table 4 Influence of temperature on ipk and Epk(n=3)

2.7 干擾物質對ipk的影響

辣椒中除辣椒堿外,在50 ℃乙醇超聲提取可溶出物中可能影響本法對辣椒堿測定的成分有:維生素C、辣椒色素及可溶性糖[24]。為了解其影響,在適宜條件下按1.2.3.4方法所做選擇性試驗結果見表5。

表5 干擾物質對辣椒堿測定的影響(n=3)Table 5 Influence of interfering substances on determination of capsaicin(n=3)

從表5可看出,在適宜條件下,添加的干擾物未達到飽和時,其循環伏安掃描圖(如圖5)與圖1無差異,未增加新的特征峰,對辣椒堿原有特征ipk的峰形和峰值未產生實質性影響,其ipk的絕對誤差為-2.53～3.75 μA,相對誤差(Er)均不超過0.94%。可見試樣中干擾物的存在并不影響測定,所以實樣測定時無需額外采取消除干擾的措施。

圖5 添加的干擾物對ipk的影響(n=3)Fig.5 Influence of additional disturbances on ipk(n=3)

2.8 標準工作曲線與檢出限的測定

在適宜條件下按1.2.4.1方法所測得結果見圖6。

由圖6得到,辣椒堿濃度(ccp)為1.0×10-4～10.0 mmol/L內ccp與ipk的方程為ipk=3.1046Ccp+1.0025(R2=0.9946),線性關系良好。依ipk～ccp工作曲線經求算此條件下測定辣椒堿的檢測限LOD=0.125×10-3mmol/L(0.3817 μg/mL),此結果與Ferraz等[20]用HPLC法的結果相當。但當ccp較高時,會使碳糊電極表面較快地被反應產物所覆蓋物,致使其電阻增加而電流降低最終導致測定結果出現較大偏差;可通過稀釋測定本底液的方法確保測定結果準確。

2.9 精密度的測定

在適宜條件下按1.2.4.2方法所測得結果見圖7。

圖7 辣椒堿測定的穩定性(n=3)Fig.7 Stability of determination of capsaicin(n=3)

由圖7可知,在適宜條件下用本法測定辣椒堿標液的ipk值受時間的影響甚小,在測試的48 h內穩定性良好(RSD≤1.8%),特別是半小時內ipk值都幾乎恒定。但隨時間的延長ipk值呈前穩中升后略降的變化態勢。產生這樣變化的原因和機理有待進一步探究。

2.10 實樣和加標回收率的測定

在適宜條件下對市售兩個批次(A、B)10種辣椒試樣的測定結果如表6、表7所示。

表7 10種辣椒實樣的加標回收率測定結果(n=3)Table 7 Recovery rate of standard addition of 10 kinds of capsicum(n=3)

由表6知,在適宜條件下,10種辣椒樣中辣椒堿含量的測定結果顯示,本法與HPLC法相當吻合,與文獻報道[25-26]也一致。且從表7可見實樣的加標回收率為100.70%～109.89%(平均103.71%),RSD為1.1%～4.9%。可見本法對辣椒中辣椒堿的測定準確可靠,能應用于實際。另外從表6、表7中還知:干辣椒中辣椒堿含量高于新鮮辣椒;辣椒品種不同其辣椒堿含量差異很大;同品種辣椒熱帶地區的印度、越南辣椒堿含量高于非熱帶地區的河南、山東。這可為需求辣椒堿含量不同的辣椒提供了參考。

3 結論

本實驗確定了循環伏安法測定辣椒堿的條件,并對測定參數進行優化。采用β-環糊精修飾碳糊電極的循環伏安法測定辣椒堿的適宜條件為:電壓掃描速率為100 mV/s,pH11,離子強度調節劑為0.10 mol/L KCl濃度控制為0.20 mol/L,測定溫度約20 ℃,在30 min內結果恒定(RSD≤0.1%)且48 h內測定結果穩定性良好(RSD≤1.8%)。該法的LOD 0.3817 μg/mL,且Ccp在1.0×10-4～1.0 mmol/L內與ipk呈極佳正相關線性關系,其方程為ipk=3.1046Ccp+1.0025,R2=0.9946。加標回收率為100.70%～109.89%(平均103.71%)。另外,本法不受辣椒試樣內物質的干擾,測定選擇性高,前處理簡單,測定速度快,靈敏度較高,可作為辣椒堿含量的定量分析方法。且本法有適合自動化和智能化快捷在線檢測的潛能。