積雪草酸對人牙周膜細胞增殖、遷移和成骨分化的影響

郝春波 鄧偉 鞏蕾 譚毅 王周凱欣

牙周膜細胞(PDLCs)的成骨分化對牙周組織的修復和再生至關重要，篩選PDLCs成骨分化過程進行調節的分子成為目前PDLCs成骨分化的熱點[1]。

積雪草酸(asiatic acid，AA)是一種烏蘇烷型五環三萜酸，主要來源于積雪草。近年來許多研究發現AA具有保肝[2]護心[3]、抗炎[4]護膚[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化應激[7]等多種生物活性，受到學界廣泛關注。

本課題組前期研究表明AA對牙齦成纖維細胞具有抗炎、抗凋亡的效果[8]。但其對間充質細胞成骨分化的作用尚未見報道。本研究旨在探討AA對牙周膜細胞的成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

低糖DMEM培養基、胎牛血清、I型膠原酶、中性蛋白酶、0.25%胰蛋白酶消化液(Gibco，美國)；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、茜素紅(Sigma，美國)； 積雪草酸(瑞芬思)； TriZol(Invitrogen，美國)；CCK8試劑盒(Transgene)；8 μm孔徑Transwell小室(BD Falcon，美國)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天)；TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTMII、PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect RealTime)(TaKaRa，日本)；GAPDH、OPN一抗、二抗(Proteintech，美國)，RUNX2一抗(Bioworld，美國)；倒置相差顯微鏡、正置顯微鏡(Leica，德國)；酶標儀(Bio-Rad，美國)；Nanodrop2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，美國)；PCR儀、實時熒光定量PCR儀7500型(ABI，美國)。

1.2 人牙周膜細胞的體外分離培養

中性蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合消化法培養原代hPDLCs，原代細胞生長至80%匯合時，用含EDTA的胰蛋白酶消化，細胞收縮變圓時吸去消化液， 收集細胞懸液， 1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入新鮮完全培養基傳代培養。實驗使用第三代細胞。

1.3 細胞增殖能力檢測

取第3 代對數生長期的牙周膜細胞，分為空白對照組和分別添加濃度為25、 50和100 μg/ml的AA組，以每孔1 000 個細胞的數目接種于96 孔板中，每孔加入100 μl完全培養基，每組設置5 個復孔。 37 ℃， 5% CO2飽和濕度中培養。 24 h后開始檢測細胞增殖情況，共檢測1～7 d共7 個時間點；多功能酶標儀檢測各孔450 nm波長A值，記錄數值，去除每組最大值和最小值并進行統計，繪制細胞增殖圖。

1.4 細胞遷移能力檢測

細胞處理分組同1.3。將各組細胞5×104個分別接種于Transwell小室的上室， 同時加入200 μl無血清培養基，下室加入600 μl含20%FBS的完全培養基， 37 ℃，5%CO2飽和濕度中培養24 h； 取出小室，甲醇固定10 min，自來水中充分漂洗1 min，輕輕擦去小室膜上層的殘余細胞和水分；小室浸泡在新鮮蘇木素染液中室溫下染色30 min，再次漂洗、干燥；顯微鏡下觀察下室的細胞，每小室取10 個不同視野進行拍照，進行細胞計數。

1.5 細胞成骨分化檢測

以105個細胞/孔的密度接種于6 孔板中，細胞生長至約80%融合時，更換為成骨誘導培養液(完全培養基中含有10 ng/ml的地塞米松、 50 mg/ml的抗壞血酸和10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉)，細胞處理分組同1.3, 每2 d換液，培養7 d后進行ALP染色，21 d后進行茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察各組ALP活性和礦化結節的形成情況。 隨后茜素紅染色的各孔加入等量西吡氯銨溶液溶解鈣化結節，酶標儀檢測各孔吸光度值。

1.6 細胞成骨分化相關基因表達檢測

以105個細胞/孔的密度接種于6 孔板中，細胞生長至約80%融合時，更換為成骨誘導培養液, 細胞處理分組同1.3, 每2 d換液，培養14 d后TriZol裂解細胞提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA純度和含量后，將其逆轉錄成cDNA，以GAPDH為內參，實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中成骨相關功能基因的表達情況。PCR反應體系，反應條件均嚴格按照試劑盒說明，引物由北京奧科公司合成(表1)。 蛋白免疫印跡實驗SDS-PAGE檢測定量采用10%的膠，上樣量20 μg， 濃縮膠采用80 V恒壓30 min， 分離膠120 V恒壓90 min，轉膜條件為200 mA 1 h， 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗在4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，隨后進行發光檢測。

表1 成骨相關基因引物序列

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 各組細胞增殖能力情況比較

CCK8實驗結果顯示，隨著時間的增加，各組增殖速率由慢轉快，第7天增殖速度區域平穩。但和對照組相比，添加各個濃度AA的各組無顯著差異，各實驗組之間也無顯著差異(圖1)。

圖1 AA對人牙周膜細胞增殖的影響

2.2 各組細胞遷移能力情況比較

Transwell小室遷移實驗結果顯示，和對照組相比，添加AA的各組穿國小室隔膜的細胞數量無顯著差異，各個實驗組之間亦無顯著差異(圖2)。

圖2 AA對人牙周膜細胞遷移的影響

2.3 各組細胞礦化能力比較

ALP活性染色結果：與對照組相比，添加25 μg/ml AA的組別無顯著差異， 但添加50 μg/ml和100 μg/ml的AA的2 個組別染色顯著加深，其中50 μg/ml AA組的染色較100 μg/ml AA組深。茜素紅染色結果和ALP染色結果一致，礦化結節溶解定量實驗顯示對照組和25 μg/ml AA組無顯著差異(表2)，而和50 μg/ml AA組的染色較100 μg/ml AA組有顯著差異， 50 μg/ml AA組的定量水平較100 μg/ml AA組顯著升高(圖3)。

表2 各組鈣結節吸光度值

圖3 AA對PDLCs礦化能力的影響

2.4 各組細胞中成骨相關基因和蛋白表達水平

7 d時的成骨相關基因RUNX2，OPN，OCN，ON表達水平較3 d為高(P<0.05)。和對照組相比， 3 d和7 d各組的RUNX2、OPN、OCN、ON表達水平均有不同程度的上調，其中添加50 μg/ml AA組上調最為顯著，除3 d時的 OPN外，均較其它各組顯著上調(圖4)。 RUNX2和OPN蛋白表達水平和mRNA趨勢一致，即在50 μg/ml AA組上調最為顯著(圖5)。

圖4 各組細胞成骨分化相關基因mRNA表達量的比較(*與3 d相比,P<0.05； 同一時間點內各組兩兩相比，不同字母組間P<0.05)

圖5 各組細胞的蛋白表達

3 討 論

牙周膜細胞的增殖、遷移和成骨分化是影響牙周組織愈合的重要因素，其中成骨分化尤為關鍵。本實驗首次證實了50 μg/ml的AA可在礦化誘導的條件下顯著促進人牙周膜細胞的成骨分化，且對細胞的增殖和遷移能力無明顯影響。 根據文獻回顧， 本實驗首次證明AA對間充質細胞成骨分化的顯著調節作用，為其在組織再生和修復方面的應用提供理論基礎。

本實驗證實50 μg/ml的AA在礦化誘導的條件下可增強人牙周膜細胞成骨功能，而對其增殖和遷移無明顯影響。推測可能原因：①增殖和遷移實驗細胞處于普通培養基微環境，而成骨誘導需要采用相應的誘導微環境，不同微環境下對細胞的特定功能影響不同；②采用更高濃度(大于100 μg/ml)的AA可能對人牙周膜細胞有顯著影響，但濃度太高可能對細胞成骨分化不利。但對AA的臨床使用而言，特定濃度可顯著促進牙周膜細胞的成骨分化，但對增殖和遷移無影響，也可在一定程度上說明該濃度對細胞無毒性作用。

鑒于本課題組發現的AA在口腔局部可發揮抗炎[8]、促成骨的特性，可以推測，在口腔局部炎癥狀態下，如牙周炎、種植體周圍炎和頜骨骨髓炎等，采用適宜的方法實現AA的局部遞送或緩釋，可發揮其抗炎功效的同時促進局部硬組織的修復，加速病損愈合。當然，這一假說需要后期大量體內實驗的驗證。

天然三萜烯代表一組具有藥理活性且不同結構的有機復合物。對這類天然植物來源的化學物質吸引著全世界學者的關注。其中最具代表性的藥物就是作為五環三萜烯的AA， 已被證實具有很廣的用途和較高的藥用價值。針對不同的疾病、不同病理階段，AA及其衍生物發揮藥理活性的作用機制可能不同，這已有大量文獻報道[9]。AA往往通過多個通路發揮功效，在抗腫瘤方面，AA可通過平衡Smad3/Smad7信號通路調節NK細胞抗腫瘤免疫能力[10]；通過降低腫瘤機制膠原從而提高腫瘤內的藥物呈遞作用[11]；通過調節PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號通路抑制人結腸癌細胞的增殖和遷移，并誘導其凋亡[12]；AA在結腸癌變過程中可縮短癌前病損、炎癥、細胞增殖，并誘導凋亡[13]。

在改善肝功能方面，AA可通過PI3K/AKT/mTOR和Bcl-2/Bax信號通路減輕CCl4誘導的肝纖維化[14]；通過抑制Notch信號通路激活減輕脂多糖誘導的損傷[15]；AA通過PPARγ/NLRP3炎性體信號通路失活Kupffer細胞保護肝臟的缺血/再灌注損傷[16]。抗神經退行性方面，AA通過抑制α突觸蛋白進入線粒體防止氧化應激和凋亡[17]；通過調節PI3K/Akt/GSK-3β信號通路發揮對分化PC12細胞的抗凋亡作用[18]；通過阻斷NF-kB/STAT3/ERK信號通路和線粒體介導的凋亡通路減輕甲基苯丙胺誘導的神經炎癥和毒性[19]。

除此以外，AA還可減輕高脂肪飲食誘導的生精損傷[20]；有學者通過在水凝膠支架材料中加入AA復合物納米顆粒，證實其能顯著促進損傷創面上皮化、膠原纖維排列和血管化，同時發揮抗炎作用[21]。本實驗證實AA促人牙周膜細胞的成骨分化，說明AA還有其它藥理活性，且可能具有廣闊的應用空間。

綜上所述，不同濃度的AA對人牙周膜細胞的增殖和遷移均無顯著影響，而中等濃度(50 μg/ml)的AA在礦化誘導的條件下可增強人牙周膜細胞成骨相關基因RUNX2、OPN、OCN、ON的表達水平，并增強其礦化能力。其具體局部應用的方式和效果，以及其具體的作用機制還需要進一步研究與證實。