中性粒細胞外泌體誘導骨髓間充質干細胞分泌成血管相關因子的研究

謝紀榮 黃鑫 牟亞群 趙路 黎哲昊 蔡卜磊 高士軍

大段骨缺損的修復一直是醫學領域的難題，其根本原因在于新生組織內血管網絡難以建立[1]，從而導致缺損區域血供不足、營養缺乏、組織壞死，最終導致治療失敗[2]。大量研究也證實提高植入物血管化程度可有效促進新骨形成[3]。因此，通過促進血管網絡的重建和再通來誘導大段骨缺損的修復再生，一直以來都是再生醫學領域的研究熱點[4]。

外泌體是一類直徑為30～150 nm的脂質雙層結構的細胞外囊泡，其含有蛋白、核酸等生物大分子用于細胞間信息傳遞，在血管、骨等多種組織再生中均具有重要作用[5]。此外，相關文獻表明：中性粒細胞可募集、自由穿梭在受損組織區域[6]，并可通過分泌多種細胞因子直接或間接地調控血管形成[7]。基于此，推測中性粒細胞來源外泌體(PMN-Exo)促進hBMSCs成血管相關因子表達，有望為骨組織工程血管化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6～8 周齡C57小鼠，雄性，體重18～20 g(第四軍醫大學實驗動物中心)。

1.2 主要試劑和儀器

α-MEM、RPMI 1640、胎牛血清(HyClone公司，美國)；Exosome-depleted FBS Media Supplement(SBI公司，美國)；OptimaTML-100 XP超速離心機(BECKMAN公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 hBMSCs的分離、培養及鑒定 知情同意下無菌收集第四軍醫大學口腔醫院正頜患者頜骨塊，α-MEM(10%FBS)沖洗骨髓提取原代，37 ℃、5%CO2常規培養至第三代待用。取第三代細胞PBS沖洗3 次，消化離心，一抗染色，流式檢測。

1.3.2 小鼠中性粒細胞(PMN)的分離及培養 分離、暴露C57小鼠骨髓腔，RPMI 1640培養液(10%無外泌體血清)沖洗、過濾，細胞計數后免疫磁珠法提取PMN，37 ℃，5%CO2孵育。

1.3.3 小鼠PMN-Exo的提取 PMN培養24 h后收集上清，依次4 ℃條件下，1 500 r/min離心10 min，取上清4 000 r/min離心10 min，取上清10 0000×g離心30 min，取上清140 000×g離心70 min，棄上清PBS重懸后140 000×g離心70 min，棄上清，適量PBS重懸得到外泌體。

1.3.4 小鼠PMN-Exo的鑒定

1.3.4.1 形態學分析 取10 μl外泌體樣品，銅網法上樣，磷鎢酸負染30 s，吸棄多余液體，靜置5～10 min晾干，80～120 kV透射電鏡成像。

1.3.4.2 粒徑分析 取1 ml外泌體樣品至樣品池，采用納米顆粒跟蹤分析法(NTA)檢測，重復3 次。

1.3.4.3 表面標志物分析 BCA法測定外泌體蛋白濃度，電泳，轉膜，5%牛奶封閉1 h，TBST洗滌，CD81、CD9、TSG101一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，發光。

1.3.5 外泌體內吞觀察 采用Dil標記外泌體，37 ℃與hBMSCs孵育2 h，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗，鬼筆環肽進行細胞骨架染色，DAPI染核，激光共聚焦下觀察。

1.3.6 實驗分組 在hBMSCs培養中分別加入PBS 10 μl和PMN-Exo 10 μl(濃度：2.9×1011/ml)，作為對照組和實驗組。

1.3.7 細胞增殖能力檢測 1×105細胞接種24 h后加入EdU工作液。48 h后4%多聚甲醛固定，PBS(含3%BSA)沖洗，0.5%Triton X-100透化，PBS沖洗，加入適量Click-iT，室溫孵育30 min，PBS沖洗后鬼筆環肽染色，Hoechst33342染核，激光共聚焦下采集圖像、分析。

1.3.8 細胞遷移能力檢測 分加外泌體組和不加外泌體組，接種細胞于24 孔板，細胞長滿后，垂直于24 孔板底面劃線，無血清培養，定時觀察、拍照，對遷移率進行分析。

1.3.9 血管生成相關基因表達評估 采用QPCR檢測血管生成相關基因VEGF、PDGF表達水平，從基因角度評估PMN-Exo對hBMSCs成血管的影響。引物序列見表1。

表1 QPCR引物列表(Takara)

1.3.10 成血管相關蛋白表達評估 采用WB檢測成血管相關蛋白VEGF、PDGF表達水平，從蛋白角度評估PMN-Exo 對hBMSCs成血管的影響。

1.4 統計學分析

使用SPSS 20.0統計軟件對數據進行統計分析，2 組間差異采用t檢驗。

2 結 果

2.1 hBMSCs的鑒定(流式細胞術)

CD流式鑒定結果表明：表達CD29、CD44的細胞分別占總細胞數的99.7%，99.9%，而表達CD34、CD45的細胞總細胞數占比分別為1.7%，2.2%(圖1)。

圖1 hBMSCs的鑒定

2.2 PMN對hBMSCs成血管相關因子表達的影響(QPCR)

PMN、hBMSCs共培養1 d后，QPCR結果顯示：與hBMSCs組相比，(PMN+hBMSCs)組成血管相關分子VEGF、PDGF表達顯著上升(圖2)，提示PMN可有效促進hBMSCs成血管能力。

圖2 hBMSCs成血管相關基因表達水平檢測

2.3 PMN-Exo鑒定(TEM、WB、NTA)

透射電鏡顯示其雙層膜結構，杯狀外形，直徑約100 nm；WB提示外泌體表面標志物CD9、CD81、TSG-101均有表達；粒徑分析(NTA)提示90%以上外泌體大小直徑在150 nm以內(圖3)，均符合外泌體鑒定標準。

圖3 PMN-Exo鑒定

2.4 PMN-Exo內吞作用觀察

結果顯示：外泌體散在分布于細胞骨架區域(圖4)，提示PMN-Exo可成功進入hBMSCs內。

圖4 PMN-Exo內吞作用(紅： PMN-Exo； 綠： 細胞骨架； 藍： 細胞核)

2.5 PMN-Exo對hBMSCs增殖能力的影響(EdU)

激光共聚焦及定量分析結果結果顯示：PMN-Exo組EdU+細胞數明顯多于PBS組(圖5)，提示PMN-Exo可顯著提高hBMSCs增殖活性。

圖5 細胞增殖活性檢測(綠： EdU+細胞； 藍： 細胞核)

2.6 PMN-Exo對hBMSCs遷移能力的影響(劃痕實驗)

結果顯示：第20小時，PMN-Exo組細胞遷移距離、細胞相對遷移率明顯大于PBS組(圖6)，提示PMN-Exo可顯著提高hBMSCs遷移能力。

圖6 細胞遷移能力檢測

2.7 PMN-Exo對hBMSCs成血管相關因子表達的影響(QPCR、WB)

第5天，QPCR及WB結果示：PMN-Exo組血管生成相關分子(VEGF、PDGF)表達明顯高于PBS組，提示PMN-Exo可顯著促進hBMSCs成血管能力(圖7)。

圖7 hBMSCs血管生成相關分子檢測

3 討 論

目前促進組織工程骨血管化的方法主要有顯微外科血管植入、支架材料復合促血管生成因子、以及支架材料復合血管內皮細胞等[8]，然而，這些方法或多或少存在著移植來源乏，細胞因子作用靶點單一、控釋難等一系列問題。因此，尋求一種高效促進組織工程骨血管化的策略顯得尤為重要。

外泌體作為一種內含豐富物質、直徑介于30～150 nm之間的功能性囊泡，可作為細胞間信號轉導的靶向傳遞介質，從而高效調控細胞的行為和命運[5]。大量研究證實不同來源外泌體在血管、骨再生中發揮重要作用。有關學者發現：內皮祖細胞來源外泌體可通過轉運miR-21-5p、抑制THBS1表達促進血管內皮細胞修復[9]；Narayanan等[10]發現：hBMSCs來源的外泌體可顯著提高體外細胞VEGF表達水平，促進hBMSCs成血管及成骨分化。

中性粒細胞是人血液中最豐富的白細胞，以往多認為其在炎癥環境下可釋放多種炎性因子促進局部血管網絡發生[7]，但其具體機制尚未闡明。而近年來發現中性粒細胞在炎癥環境下所釋放的外泌體有顯著的促進組織修復的作用[11]，因此推測：中性粒細胞來源外泌體(PMN-Exo)可能具有促進血管新生，加速組織修復的重要作用。

本研究首先成功鑒定hBMSCs[12]，在驗證PMN對hBMSCs成血管相關因子調控作用之后，分PBS組和PMN-Exo組，并對其內吞、增殖、遷移、分化能力進行了系列研究。與以往研究結論一致[7]，PMN與hBMSCs共培養1 d后血管生成相關因子表達明顯上升，證實了PMN可能在血管新生中有積極作用，但由于PMN自發凋亡的限制[13]，難以對其進行長時間研究。本研究從多個角度對PMN-Exo進行了鑒定，并驗證了其良好的hBMSCs內吞效果。細胞學結果表明：與PBS組相比，PMN-Exo組hBMSCs增殖活性更強、遷移速率更快、成血管相關因子表達更高。本研究初步證實了PMN-Exo可能是PMN加速組織內血管新生的潛在因素，后期實驗將進一步驗證PMN-Exo促進BMSCs表達血管再生因子的具體分子機制并在動物模型體內進行驗證。

總之，中性粒細胞來源外泌體可有效促進hBMSCs成血管相關因子表達，進而可能促進血管新生，有望為骨組織工程血管化提供新思路。