14-3-3σ蛋白在TCDD致胎鼠腭裂中的作用機制的初步研究

蔣亨 王晨 袁心剛 傅躍先

腭裂是顱面部最常見的先天畸形之一[1]。2,3,7,8-四氯二苯二噁英(TCDD)具有發育毒性，導致小鼠胚胎腭裂高發[2]。本課題組前期以iTRAQ技術篩選TCDD與維甲酸致胎鼠腭裂發生的共同差異蛋白，發現14-3-3σ蛋白在TCDD與維甲酸致C57BL/6J胎鼠腭裂腭突標本中顯著升高[3]。14-3-3蛋白家族在真核生物中廣泛存在并高度保守，在多種生物過程中扮演重要角色[4]。其中14-3-3σ蛋白在調節上皮細胞增殖和分化中發揮獨特作用[5]。14-3-3σ蛋白是P53的靶基因，P53通過調控14-3-3σ蛋白的表達調節細胞周期阻滯來應對DNA損傷[6]。本研究通過檢測不同時期胎鼠腭突組織中14-3-3σ蛋白和mRNA、P53和磷酸化P53蛋白的表達，來探討14-3-3σ蛋白在TCDD致胎鼠腭裂畸形中可能的作用及調控機制。本研究經重慶醫科大學醫學研究倫理委員會批準(編號： 20170120-2)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 均符合實驗室動物倫理標準，動物殘余組織均由動物實驗中心統一生物無害化處理。選擇6～8 周齡、18～20 g的SPF級建康C57BL/6J小鼠雌鼠60 只，雄鼠20 只〔重慶醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝) 20050002]〕，飼養于SPF級動物實驗室，溫度22～24 ℃，濕度(55±5)%，循環光照明暗各12 h，普通實驗室飼料、水源，自由飲水、攝食。 適應新環境2 周后，于黃昏按雌雄比例2∶1或3∶1合籠交配，次日晨雌雄分籠，檢查雌鼠陰栓，稱重標記；記錄當天為胚胎期第0.5天(E0.5)觀察體重至E10.5，體重增長小于2 g者視為未孕，重新合籠。最后獲取48 只符合要求的孕鼠用于實驗。

1.1.2 實驗試劑 TCDD、玉米油(Sigma-Aldrich公司,美國)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒和抗β-actin抗體、抗P53多克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；14-3-3σ蛋白抗體(GeneTex公司，美國)；DAB試劑盒、辣根過氧化物酶標記和兔二步法檢測試劑盒二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RNAiso Plus、SYBR?Premix EX TaqTMⅡ和PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara公司，日本)；PBS磷酸鹽緩沖粉劑(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；抗磷酸化P53多克隆抗體(SANTA CRUZ公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物處理與樣本收集 將48 只孕鼠隨機分為TCDD組與對照組，在E10.5時，按TCDD 28 μg/kg(以玉米油配制成5 μg/ml)給予孕鼠一次性灌胃；對照組等體積玉米油灌胃。各組孕鼠分別在E13.5、E14.5及E15.5二氧化碳麻醉處死。無菌條件下配合體式顯微鏡(Nikon DXM1200F)從孕鼠子宮取出胎鼠，剪取胎鼠頭部，觀察腭突生長情況并記錄；部分完整胎頭置于4%多聚甲醛溶液(4%PFA,pH 7.4)固定，腭突組織-80 ℃保存待用。

1.2.2 HE染色及免疫組組織化學染色 將2 組E13.5、E14.5及E15.5獲得的胎頭立即放入4%PFA(pH 7.4)中固定48 h后，胎頭脫水后石蠟包埋，做頭部冠狀面連續切片(4 μm)，部分切片常規HE染色，光鏡觀察拍照。用兔二步法檢測試劑盒檢測14-3-3σ蛋白組織表達：將切片脫蠟復水后，滴加3%過氧化氫溶液于切片上，濕盒孵育10 min，進行內源性過氧化物酶的淬滅處理。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，微波中大火力加熱至沸騰并保持8 min，取出容器，待緩沖液溫度自然降到室溫，反復2 次，完成抗原修復。滴加5%山羊血清，室溫濕盒封閉30 min，滴加兔抗小鼠14-3-3σ蛋白的抗體(稀釋1∶500)于切片上，4 ℃孵育過夜。 第2天，按照試劑盒說明書先后滴加試劑1、2，均在室溫濕盒孵育15 min，漂洗后，按DAB試劑盒說明書配制DAB工作液后顯色15 s左右，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，脫水后滴加中性樹脂，蓋玻片封片，置于光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 總RNA提取和實時定量PCR 用體視顯微鏡在無菌條件下剪取腭突。使用RNAiso Plus提取總RNA。根據說明書，使用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒進行逆轉錄。逆轉錄反應液被稀釋相同倍數并作3個復孔，反應體系共10 μl: SYBR?Premix EX TaqTMⅡ 5 μl(Takara，日本)，上下引物各0.4 μl(10 μmol/L)，cDNA 0.8 μl，去酶水3.4 μl。反應系統：CFX96 real time system(Bio-Rad，美國)。反應條件：95 ℃ 預變性30 s，40 個循環(95 ℃變性5 s，50.4 ℃退火30 s)，溶解曲線。使用2-ΔΔct方法計算相對定量值。引物的設計和合成均由上海生物工程技術公司完成，根據NCBI Nucleotide數據庫，比對引物特異性。引物序列見表1。

表1 小鼠14-3-3σ及內參β-actin引物序列

1.2.4 蛋白免疫印跡 將50 mg腭突組織用勻漿器冰上研磨，并按試劑說明書提取總蛋白質。使用BCA蛋白濃度定量試劑盒測定每個樣品中總蛋白質的濃度。使用SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒制備12%SDS-PAGE凝膠，電泳分離蛋白質(35 μg)并轉移到PVDF膜。將膜浸入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，在室溫下封閉2～3 h，將膜分別與抗14-3-3σ蛋白多克隆抗體、抗P53多克隆抗體、抗磷酸化P53多克隆抗體及抗β-actin多克隆抗體，稀釋比均為1∶1 000，在4 ℃孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的二抗以1∶2 000室溫孵育2 h，以超敏ECL試劑顯影拍照(基因，Gene Gnome5)，Image J分析灰度值。目的蛋白的相對表達量用目的蛋白條帶灰度值與同一總蛋白的β-actin條帶灰度值的比值來表示。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 對照組與TCDD組胎鼠腭部發育

E13.5～E15.5，對照組從孕鼠獲得活胎鼠共計144 只，死胎和吸收胎3 只，E15.5活胎未見腭裂發生；E13.5～E15.5，TCDD組獲得活胎鼠共139 只，死胎和吸收胎5 只，E14.5活胎中可見大部分雙側腭突未能接觸，E15.5腭裂發生率100%。腭部冠狀HE染色切片觀察發現：E13.5，對照組雙側腭突垂直于舌體兩側向下生長，TCDD組兩側腭突亦垂直于舌體兩側向下生長，但較對照組腭突小且生長遲緩；E14.5，對照組兩側腭突抬升至舌體上方，呈水平位向對側生長互相接觸并形成腭中縫，TCDD組舌體下降延遲，兩側腭突亦未能抬升至水平方向；E15.5，對照組腭中縫上皮消失，雙側腭間充質部匯合，腭融合完成，形成完整腭部，將鼻腔和口部隔開，TCDD組雙側腭突雖抬升至水平位，但腭突發育遲緩，且未能在中線處相互接觸和融合，形成腭裂(圖1)。

P: 腭部; T: 舌體; NS: 鼻中隔; B: 腦組織; Mdb: 下頜骨

2.2 14-3-3σ蛋白在腭突組織的表達

E13.5兩組均未見明顯的14-3-3σ蛋白陽性表達細胞。E14.5，對照組口腔和鼻腔側上皮三角及腭中縫上皮可見14-3-3σ蛋白陽性表達細胞；TCDD組腭突尖端與舌體接觸處附近上皮有14-3-3σ蛋白陽性表達細胞。E15.5，對照組僅在腭部口腔側原上皮三角上皮有少量14-3-3σ蛋白陽性表達細胞；TCDD組腭突內側上皮可見局部14-3-3σ蛋白陽性表達細胞,實線框內為間充質部14-3-3σ蛋白陽性表達細胞(圖2)。

實時熒光定量PCR檢測結果顯示：TCDD組14-3-3σ mRNA表達較對照組升高(P<0.05,表2)。

表2 胎鼠腭突組織14-3-3σ mRNA相對表達量

P： 腭突； T： 舌體； Mdb： 下頜; 箭頭指示14-3-3σ蛋白陽性表達細胞

2.3 14-3-3σ蛋白及相關蛋白表達

TCDD組14-3-3σ蛋白表達為較對照組顯著升高(P<0.05,表3)。

E13.5，TCDD組P53蛋白表達較對照組升高(P<0.05)，E14.5和E15.5，2 組P53蛋白表達差異無統計學意義(表3)。E13.5和E14.5，TCDD組磷酸化P53蛋白表達較對照組顯著升高(P<0.05)；E15.5，2 組磷酸化P53蛋白表達差異無統計學意義(表3，圖3)。

表3 胎鼠腭突組織14-3-3σ、P53和磷酸化P53蛋白相對表達量

N: 對照組(Control group)； T： TCDD組(TCDD group)

3 討 論

在小鼠模型中，雙側腭突的內側邊緣上皮(MEE)在E14.5時開始接觸并黏附到對側腭突，MEE形成腭中縫(MES)，并最終消失。MES的消失和間充質連續性的建立對于完成腭融合過程是必不可少的[7]。通常認為MEE通過細胞凋亡、上皮-間質轉化(EMT)和上皮遷移而消失，MEE細胞未能崩解，阻止兩側腭突融合導致腭裂[8]。

本課題組前期探索出TCDD 28 μg/kg是建立C57BL/6J胎鼠腭裂模型的最適劑量[9]。Yamada等[2]發現，在E14～E16，TCDD處理的胎鼠中有一部分被觀察到雙側腭突互相接觸，但是最終所有腭突都不會融合并且相互分離，有研究者三維重建腭器官也發現實驗組雙側腭突延遲于對照組靠攏,但并未融合,形成腭裂[10]。這提示TCDD組腭突雖然生長遲緩，但亦有部分腭突接觸，又分開，最后所有胎鼠呈現腭裂表型。本研究中HE切片未觀察到TCDD組雙側腭突接觸，可能是因為腭突從接觸到分開這個過程極為短暫、不易觀察。有學者發現，14-3-3σ蛋白通過介導Yap1的細胞定位來調節皮膚角質形成細胞的增殖和分化[11]。亦有研究發現，14-3-3σ蛋白基因沉默穩定c-Jun蛋白導致上皮細胞向間充質細胞轉變的激活[12]。本實驗免疫組化發現14-3-3σ蛋白主要表達于與腭突接觸和融合密切相關的腭上皮細胞中。且14-3-3σ蛋白在TCDD組E13.5、E14.5和E15.5均較對照組表達升高。E13.5～E15.5是腭部發育關鍵時期，E14.5更是腭中縫上皮細胞在雙側腭突接觸后形成腭中縫的關鍵時間點[13]。結合免疫組化的結果，少部分MEE遷移至間充質部，卻因14-3-3σ蛋白持續表達而未能向間充質轉化，我們推測TCDD組14-3-3σ蛋白在這一關鍵時期表達升高抑制了上皮間充質轉化，維持MEE細胞表型，使得接觸的雙側腭突復又分開，導致腭裂發生。14-3-3σ蛋白是受P53調控的G2周期調控分子，P53主要通過P21和14-3-3σ蛋白誘導細胞周期停滯[6]。磷酸化P53蛋白是P53蛋白的激活狀態。在本實驗中檢測到E13.5時TCDD組P53蛋白表達較對照組升高，E13.5和E14.5時TCDD組磷酸化P53蛋白較對照組表達升高；推測TCDD在E10.5作用于胚胎后引起腭發育早期(E13.5)P53蛋白表達量升高，磷酸化P53在E13.5和E14.5表達量亦升高，促進14-3-3σ蛋白表達上調，誘導細胞周期阻滯，干擾正常腭發育進程。

總之，本研究提示14-3-3σ蛋白在TCDD組腭發育關鍵時期表達升高，可能是腭發育早期TCDD作用下P53通路激活，引起細胞周期阻滯所致。并且TCDD組14-3-3σ蛋白表達升高，可能抑制上皮間充質轉化，使得腭中縫上皮持續存在，干擾了正常的腭發育進程，導致腭裂形成。但14-3-3σ蛋白在腭發育過程中所起的作用，尚需要進行更深入的研究，以期為孕期腭部發育異常的防止帶來新的干預靶點。