雌激素受體β基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸多態性與子宮內膜異位癥的關系研究

郝娜，田蕓婕，賈亞靜，路曉琳

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)多發于育齡期婦女，由多因素、多遺傳基因作用導致具有活性的子宮內膜組織異位，生長在子宮腔以外并反復周期性出血，從而引起患者慢性盆腔痛、痛經、不孕等[1-2]。近年來，隨著社會快速發展，生活節奏加快，臨床上EMs發病率呈逐年升高的趨勢，成為臨床上常見且危害較大的一類婦科疾病，嚴重影響婦女的生活質量、生育功能和身心健康[3]。目前EMs的發病機制尚未得到明確闡明，臨床上也缺乏治療EMs的特效藥，因此探究與EMs發生發展相關基因，以期找尋預防、診斷和治療EMs的新靶點對EMs患者意義重大。雌激素受體β(estrogen receptorβ，ERβ)作為可溶性糖蛋白分子在轉錄水平上調節基因表達，雌激素在機體內發揮生理功能必須通過ERβ介導[4-5]。EMs受雌激素調控，因此ERβ基因的變化可能影響雌激素的生理作用，從而導致EMs發病[6]。ERβ基因在EMs患者血清中表達水平未見相關研究，因此本研究使用聚合酶鏈反應—限制性內切酶片段長度多態性方法檢測EMs患者血清中ERβ基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸多態性，分析rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率與EMs患者臨床病理特征的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取于2017年6月—2019年6月邯鄲市中心醫院、河北醫科大學第四醫院婦科收治的60例EMs患者作為研究對象(EMs組)，依據2015年“子宮內膜異位癥的診治指南”[7]，超聲影像為無回聲區內有密集光，腹腔鏡檢觀察病變形態，經病理檢查確診。EMs組年齡21 ～51(35.23±3.48)歲，體質量指數(22.94±3.19)kg/m2；根據美國生育協會在1997年修訂的EMs分期(R-AFS)[8]，Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期19例，Ⅳ期21例；病理類型，卵巢型21例，腹膜型20例，混合型19例；痛經情況，無或輕度痛經29例，中或重度痛經31例；產次，0次11例，1次34例，≥2次15例；有流產史33例；有不孕史19例。另選取同期來邯鄲市中心醫院體檢的健康女性67例作為對照組，年齡22～52(36.17±2.91)歲，體質量指數(22.74±4.50)kg/m2；產次，0次13例，1次36例，≥2次18例；有流產史36例；有不孕史20例。2組受試者年齡、體質量指數、孕產情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，入選者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標準 納入標準：(1)月經周期正常；(2)6個月內未曾使用激素類藥物。排除標準：(1)患有其他婦科腫瘤或婦科病的者；(2)伴有心、腎、肝功能不全者；(3)免疫功能缺陷者；(4)處于妊娠期的受試者。

1.3 主要試劑和儀器 rs1256064和rs1256049引物序列由上海生物工程公司合成；DNA提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；SimpliAmp PCR儀購自美國賽飛世爾科技有限公司。

1.4 檢測方法 清晨取所有受試者空腹靜脈血6 ml，用肝素抗凝，隨后置于-20℃冰箱中待用。

1.4.1 用DNA提取試劑盒提取基因: rs1256064位點上游引物序列5’-TGATTGCTCAGCACATAGCC-3’，下游引物序列5’-GACAGGTCTTCAGCACCACA-3’；rs1256049位點上游引物序列5’-TCTACACACACAGGGAGCTGA-3’，下游引物序列5’-CAGGACTTTGTTCCCACTCAC -3’；PCR擴增體系共20.0 μl，其中上下游引物(5μmol)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl，SYBR Mix 10.0 μl，cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl。PCR反應條件：95℃ 5min，(95℃變性45s，60℃延伸60s)×40，72℃ 10min。

1.4.2 酶切PCR擴增引物: rs1256064和rs1256049位點的PCR產物經RsaⅠ限制性內切酶進行酶切，酶切體系共20.0 μl，其中PCR擴增產物16 μl，10×Buffer 2.1 μl，RsaI 0.7 μl，BSA 0.2 μl。酶切反應條件為37℃ 4 h。將酶切后的產物經凝膠電泳分析，凝膠成像儀成像，隨后根據酶切產物片段的大小確定基因型。

2 結 果

2.1 2組rs1256064位點基因型和等位基因頻率比較 經PCR擴增出rs1256064位點基因318 bp片段，經RsaⅠ限制性內切酶酶切后產生153 bp和165 bp 2個片段，在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對照組相比，EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數顯著升高，PP基因型數顯著降低(P<0.01)，p等位基因頻率顯著升高，P等位基因頻率顯著降低(P<0.01),見表1。

2.2 2組rs1256049位點基因型和等位基因頻率比較 經PCR擴增出rs1256049位點基因299 bp片段，經RsaⅠ限制性內切酶酶切后產生105 bp和172 bp 2個片段，在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對照組相比，EMs患者組rs1256049等位基因PP基因型數顯著升高，Pp基因型數顯著降低(P<0.05)，P等位基因頻率顯著升高，p等位基因頻率顯著降低(P<0.05), 見表2。

2.3 rs1256064、rs1256049位點基因與子宮內膜異位癥臨床病理特征的關系 rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無流產、有無不孕史有關(P<0.05)，與EMs患者年齡、病理類型、有無痛經、產次無關(P>0.05)， 見表3。

2.4 影響子宮內膜異位癥發病的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析表明，臨床分期、不孕史、rs1256064位點p等位基因頻率升高、rs1256049位點P等位基因頻率升高是EMs發病的危險因素(P<0.05)，見表4。

表1 2組rs1256064位點基因型和等位基因頻率比較

表2 2組rs1256049位點基因型和等位基因頻率比較

表3 rs1256064和rs1256049位點與子宮內膜異位癥臨床病理特征的關系 [例(%)]

表4 影響EMs發病的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

EMs因侵襲性強、復發率高成為臨床上婦科難治疾病，育齡期婦女發病率高達10%，成為婦女不孕癥的危險因素[9-10]。有研究發現，不孕癥婦女患者中25%～50%伴有EMs，盆腔體檢正常的育齡女性超過50%患有不同程度的EMs。到目前為止，很多學者對EMs的發病機制開展大量的臨床研究和基礎實驗，但仍無法完全闡述EMs的具體發病機制[11-12]。學術界對免疫學、子宮內膜種植、遺傳學發病機制頗有爭論，隨著生物學研究的不斷發展，ERβ基因與EMs發生發展的關系受到重視，成為研究的熱點[13]。但大多從細胞或動物模型上探討ERβ與EMs的關系，在臨床上未曾對ERβ基因具體核苷酸位點進行研究。因此本研究選ERβ基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸，試圖從基因水平上找尋ERβ基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸多態性與EMs發病之間的相關性。

ERβ基因由40 kb堿基組成，位于14q23-24.1，包含8個外顯子和7個內含子，廣泛分布在兩性組織和生殖器官中，在人乳腺、卵巢、子宮內膜中表達，且分泌期低表達，增生期高表達[14-15]。研究發現，ERβ可能與子宮內膜癌、子宮內膜異位癥相關[16]。李鵬程等[17]研究發現，ERβ在EMs大鼠模型子宮內膜中高表達，可上調血管內皮生長因子(VEGF)、氨基末端激酶(c-Jun)表達水平，在EMs發展中發揮重要作用。在廣西壯族絕經婦女血清雌二醇、孕酮水平研究中，ERβ基因經Rsa-Ⅰ內切酶酶切出RR、Rr、rr、r、R基因組，r基因組孕酮和雌二醇水平顯著降低，黃體生成素、促卵泡激素顯著升高[18]。本研究發現，經PCR擴增出rs1256064位點基因318 bp片段，經RsaⅠ限制性內切酶酶切后分別產生153 bp、165 bp 2個片段，與對照組相比，EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數和p等位基因頻率顯著升高，PP基因型數和P等位基因頻率顯著降低，提示rs1256064位點基因與EMs相關。對rs1256049等位基因研究發現，經PCR擴增出rs1256049位點基因299 bp片段，經RsaⅠ限制性內切酶酶切后產生105 bp和172 bp 2個片段，與對照組相比，EMs組患者rs1256049等位基因PP基因型數和P等位基因頻率顯著升高，Pp基因型數和p等位基因頻率顯著降低，提示rs1256049位點基因與EMs有關，可能此類基因特征患者更易患EMs。臨床病理特征分析發現，rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無流產、有無不孕史有關，與EMs患者年齡、病理類型、有無痛經、產次無關，提示rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率可能參與EMs進程，與EMs發生發展相關，多因素Logistic回歸分析表明，臨床分期、不孕史、rs1256064位點p等位基因頻率升高、rs1256049位點P等位基因頻率升高是EMs發病的危險因素，提示該類患者具有患EMs風險，應定期體檢，注意防治。

綜上所述，EMs患者rs1256064位點基因pp基因數和p等位基因頻率、rs1256049位點基因PP基因數和P等位基因頻率顯著升高，與患者臨床分期、不孕史有關，是EMs患病的危險因素，提示rs1256064和rs1256049位點可能作為早期預防和判斷EMs的臨床指標。但rs1256064和rs1256049位點基因具體作用機制還有待從動物和細胞模型進行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

郝娜：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；田蕓婕：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；賈亞靜：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；路曉琳：進行統計學分析