BDNF Val66Met基因多態(tài)性與老年糖尿病患者認知功能損害的相關性

劉佳，羅鴻宇，王潔妤，張麗，但小娟，楊偉

糖尿病是老年人群的常見疾病，常伴隨著認知功能損害，其阿爾茨海默病(AD)發(fā)病率增高[1-2]。然而目前糖尿病出現(xiàn)認知功能損害的確切機制仍不明確。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經營養(yǎng)素家族的一員，與神經元的生長、分化、增殖、可塑性及大腦的認知和記憶密切相關[3]。有研究證實，血BDNF水平在AD和糖尿病患者中下降[4-6]，但也有研究結果卻不一致[7-8]，可能是由于血清BDNF易受降糖降脂藥物、生活方式如運動、吸煙和飲酒等多種因素的影響[9]。Val66Met基因位于BDNF基因的編碼外顯子，其G/A多態(tài)性導致編碼的第66位氨基酸發(fā)生纈氨酸—甲硫氨酸(Val-Met)轉換，從而影響B(tài)DNF分泌[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在健康人群中風險等位基因A攜帶者海馬體積和海馬相關記憶下降, 可能與AD發(fā)病相關[11-12]。糖尿病人群與健康人群比較，A等位基因攜帶者延遲回憶能力減退[4]。但該位點與老年糖尿病人群認知功能下降是否相關目前少有報道。本研究分析了老年糖尿病患者認知功能障礙與BDNF基因多態(tài)性的相關性，探討2型糖尿病認知功能損害的可能機制，以期望為糖尿病認知功能損害提供個體化治療依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月—2019年5月首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院老年科診治糖尿病患者(年齡≥65歲)592例，其中認知損害(CI)組189例，認知正常組403例，見表1。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，入組對象或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 入組標準 納入標準：(1)年齡≥65歲；(2)糖尿病診斷標準符合“中國2型糖尿病防治指南2017年版”[13]；(3)文化程度在初中及初中以上者。排除標準：(1)影像學檢查有明確神經系統(tǒng)疾病史(腦血管病、帕金森病等)；(2)嚴重內科疾病不能配合檢查者，中重度貧血及甲狀腺功能減退者；(3)糖尿病高滲或酮癥酸中毒；(4)明確的精神疾病等；(5)嚴重視力或聽力障礙。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床資料：(1)臨床特征，包括身高、體質量、體質量指數(shù)(BMI)、疾病情況及降糖藥用藥信息[二甲雙胍、胰島素、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶4(dipeptidy1 peptidase-4, DPPⅣ)抑制劑]等；(2)生化指標，空腹血糖(FPG)，糖化血紅蛋白(HbA1C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；胰島素抵抗指數(shù)(HOMA2-IR) 通過計算軟件(www.ocdem.ox.ac.uk)獲得[14]；(3)認知功能評定，采用簡易智能評估量表(MMSE)評估，共30項，分為定向力、短時記憶、計算及注意力、延遲回憶和語言能力等5部分，總分范圍0～30分。根據中國癡呆與認知障礙指南寫作組制定的認知障礙標準，文盲組≤19分，小學組≤22分，初中以及上≤ 26分為認知功能損害[15]。

1.3.2 基因分型檢測：采取靜脈血5 ml抗凝處理，按照QIAGEN公司基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA。BDNF Val66Met上游引物5’-AAGAAGCAAA-CATCCGAGGACA-3’,下游引物5’-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’，引物由上海生工合成。然后應用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術擴增目的DNA片段。酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，根據電泳條帶遷移速率不同進行分析，對BDNF Val66Met進行基因分型。

2 結 果

2.1 2組臨床資料比較 2組的性別、年齡、高血壓病史、BMI水平、Ln HOMA2-IR及其他口服降糖藥物相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與認知正常組比較，CI組的糖尿病病程、HbA1C、血LDL-C、空腹血糖水平增高，而受教育時間(年)偏低及口服二甲雙胍比例下降(P均<0.05)，見表1。

2.2 2組BDNF Val66Met 基因多態(tài)性比較 其在總人群中分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，最小等位基因(A)頻率為46.6%。雖然3種基因型GG、AG、AA在CI組和認知正常組之間分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是風險等位基因A在CI組中分布明顯高于認知正常組(51.1%vs.44.5%，P=0.036)，見表1。

表1 2組一般資料和BDNF基因多態(tài)性分布比較

2.3 BDNF基因多態(tài)性與MMSE分值的相關性分析

2.3.1 BDNF基因多態(tài)性MMSE分值比較：在總人群中等位基因A攜帶者的語言能力及定向力、延遲回憶分值低于非攜帶者(P<0.05)，但在MMSE總分值、短時記憶和計算能力方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 BNDF Val66Met基因多態(tài)性中MMSE各項分值的比較分)

2.3.2 BDNF風險等位基因與MMSE分值的線性相關分析：進一步分析BDNF Val66Met風險等位基因A與MMSE總分以及各分值的相關性(見表3)。采用線性回歸分析，調節(jié)表1有顯著差異的相關因素后，每拷貝風險等位基因A與MMSE(β=-0.096,P=0.011), 定向力(β=-0.155,P<0.001)，延遲回憶(β=-0.134,P=0.001)呈負相關，但在短時記憶、計算及注意力和語言能力方面無顯著相關性(P>0.05)。

2.4 糖尿病患者認知功能障礙的多因素分析 將表3中有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的因素采用Logistic多因素回歸分析，結果顯示，糖尿病病程、FPG、HbA1C、LDL-C是糖尿病認知功能障礙的獨立危險因素，受教育時間和口服二甲雙胍是糖尿病認知功能障礙的保護因素(P均<0.05)，見表4。此外，BDNF Val66Met是糖尿病人群認知功能障礙風險基因，其等位基因A攜帶者(AA+GA)認知障礙發(fā)病風險是非攜帶者的1.696倍(95%CI1.119～2.569，P=0.013)。高血壓與老年糖尿病患者認知功能減退無明顯相關性(P>0.05)。

表3 BDNF風險等位基因與MMSE各項分值的相關性分析

表4 老年糖尿病患者認知功能障礙多因素Logistic回歸分析

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病人群比較，糖尿病患者認知功能障礙的發(fā)生率增加了1.5倍，其危險因素主要包括血糖代謝紊亂、胰島素抵抗、血脂異常、血壓增高、肥胖及遺傳因素如APOE基因等[2]。而近期針對糖尿病人群橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，認知損害組在腦卒中、高血壓及抑郁方面比例均高于糖尿病認知正常組，而在飲酒、吸煙、血脂水平、空腹血糖、BMI及APOE風險基因方面差異無統(tǒng)計學意義[16-18]。而本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病程、HbA1C及LDL-C水平增高均是糖尿病認知功能下降的危險因素，但并未發(fā)現(xiàn)高血壓人群在認知損害組中比例增高，可能與高血壓本身就是腦卒中的高危因素有關，既往研究中未除外腦卒中患者，糖尿病所造成的認知功能損害可能混入了高血壓導致的腦卒中從而引起認知功能下降，此外既往研究對象還包含了抑郁癥患者，因此導致了結果的差異。而本研究在研究對象選擇方面除外糖尿病合并腦卒中和抑郁癥患者，其相關性結果更能準確體現(xiàn)糖尿病與非血管性認知功能障礙及阿爾茨海默病(AD)之間的聯(lián)系。目前二甲雙胍與糖尿病認知功能的相關性無一致結論，有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍造成的維生素B12和鈣的缺乏可以增加認知功能損害的風險[19-20]，但另一些研究卻相反[21-22]，本研究顯示二甲雙胍是糖尿病患者認知功能損害的保護因素，補充維生素B12及鈣劑是否與二甲雙胍對認知功能的影響有關，還需進一步研究證實。

血BDNF水平在T2DM 人群中較正常人群降低[4-6]，而BDNF Val66Met 基因多態(tài)性可以影響B(tài)DNF細胞內運輸和活動依賴性分泌從而影響B(tài)DNF的功能[10]。 該基因多態(tài)性分布頻率因人種的不同而出現(xiàn)差異，在亞洲人群A等位基因的分布頻率最高達48.1%[23]，較歐洲人群增高2倍以上[6]。在亞洲人群中研究發(fā)現(xiàn)，對比T2DM和正常組人群認知功能，2組間基因分布頻率無顯著差異，但在延遲回憶分值方面A等位基因攜帶者較非攜帶者顯著下降[24-26]。因此推測BDNF Val66Met 基因多態(tài)性并非直接影響了T2DM易感性，而是對糖尿病患者部分認知域下降造成了影響。糖尿病認知功能損害常伴隨多個認知域，如即刻記憶、延遲記憶、學習和執(zhí)行能力的下降[21]。本研究以老年人群為研究對象，結果顯示在總人群中A等位基因分布頻率為46.6%，并發(fā)現(xiàn)風險等位基因A增加可導致延遲回憶分值下降，與以往研究一致[4]。此外A等位基因攜帶者在定向力和語言能力方面分值較非攜帶者下降。在調整學歷和糖尿病病程等其他危險因素后，提示BDNF Val66Met可能是老年T2DM認知功能損害的獨立危險因素。

目前BDNF Val66Met對認知功能影響的機制尚不明確。一方面，有研究發(fā)現(xiàn)，Val66Met基因突變在健康人群中可以影響海馬相關的記憶功能和海馬體積[12]，與正常人群海馬相比，散發(fā)型阿爾茨海默病患者海馬中BDNF表達明顯降低，這些結果提示BDNF基因突變及造成隨后蛋白水平的變化可能與AD的早期病理改變有關[11-12]。此外該位點還能通過影響神經元BDNF的功能，與一些神經系統(tǒng)和精神疾病相關。另一方面，Val66Met位點突變導致BDNF表達下降，而BDNF可以通過刺激生長激素抑制素的表達增加β-淀粉樣蛋白的降解[27]，從而導致AD的發(fā)生。在糖尿病人群中，胰島素抵抗和高胰島素血癥，可能導致腦內胰島素作用減弱，Aβ生成增多和降解減少，從而使神經元產生退行性改變[2,28]，可形成AD的相關病理改變，出現(xiàn)認知功能障礙。此外，糖尿病病變本身出現(xiàn)的顱內微血管慢性缺血病變，也會造成認知功能的損害。而BDNF Val66Met多態(tài)性是否會加劇糖尿病人群胰島素抵抗、高胰島素血癥及微血管病變需要更進一步的研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)BDNF Val66Met基因是老年糖尿病患者認知功能損害的風險基因，但是本研究為病例對照研究，BDNF Val66Met風險等位基因攜帶者對糖尿病患者認知功能障礙發(fā)病風險的影響還需要進一步前瞻性研究來證實。此外本研究的局限性還在于認知功能損害重要的風險基因APOE未納入分析。故今后進一步擴大樣本量，探討2種風險基因對老年糖尿病患者認知功能的影響。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉佳:實施研究過程，數(shù)據統(tǒng)計分析，撰寫論文；羅鴻宇、張麗：實施主要研究過程；王潔妤：設計研究流程和方案；但小娟:數(shù)據的統(tǒng)計和分析，進行文獻調研與整理；楊偉：提出研究方向及思路，參與論文修改