柱前衍生化HPLC法分析馬卡列丙多糖中單糖的組成*

龔開妍，智馨君，朱 戀，譚紫玲，劉良紅，蔡 偉

(湖南醫藥學院藥學院，湖南 懷化 418000)

馬卡列丙(侗藥名),拉丁名為Duhaldeanervosa(Wallich.ex Candelle)A.Anderberg,又稱毛秀才，小黑藥，是菊科羊耳菊屬顯脈旋覆花的多年生草本植物[1],主要分布于我國西南地區和東南亞等地[2]。馬卡列丙，在云南可作為香料食用，亦可作為民間藥物，具有祛風寒, 通經絡, 消積止痛等功效，主要用于風濕疼痛, 脘腹冷痛,偏頭痛，跌打損傷，骨折等疾病的治療[3-4]。馬卡列丙中除了含有萜類，甾體等成分[5-6]，還含有本課題組前期研究發現的綠原酸類和多糖類成分[7-8]。多糖是生物體內重要的生物大分子，具有抗腫瘤，增強免疫力等多種藥理作用[9-11]。多糖的單糖組成是多糖結構研究的前提，是生物活性和開發利用研究的關鍵[12-13]。目前，尚未有馬卡列丙多糖研究的文獻報道。基于此，本研究采用水提醇沉法和sevag法脫蛋白得到馬卡列丙精多糖，并采用柱前衍生化法結合高效液相色譜法，分析了侗藥馬卡列丙多糖中單糖的組成及其摩爾比。

1 儀器與試藥

1.1 藥 材

馬卡列丙購自云南,經湖南醫藥學院汪冶教授鑒定為顯脈旋覆花的根。

1.2 儀 器

Agilent1260高效液相色譜儀(含G1311B四元泵和G4212B二極管陣列檢測器)，美國Agilent公司；AUW120D電子分析天平，日本島津公司；Mighty-10超純水機，上海礫鼎水處理設備有限公司。

1.3 藥品與試劑

木糖，甘露糖，阿拉伯糖，葡萄糖均購自南京春秋生物有限公司；乙腈(色譜純)，美國Tedia公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；實驗用水由超純水機制得；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 多糖的提取

取馬卡列丙干燥粉末，精密稱定10 g，加入500 mL純水于70 ℃水浴鍋中水浴回流1 h，提取3次，合并提取液進行減壓濃縮。濃縮液加95%乙醇至含醇量達80%，4 ℃過夜后離心，收集沉淀，干燥即得粗多糖。將提得的粗多糖用純化水溶解置分液漏斗中，加入Sevag試劑(三氯甲烷:正丁醇=4:1)除蛋白，Sevag試劑加入量為多糖溶液的1/4，充分振搖30 min后，經離心機離心1 min,收集水相，在水相中繼續加入Sevag試劑除蛋白，重復上述操作4次，收集水相，加入95%乙醇至含醇量達80%，離心收集沉淀物，用無水乙醇、丙酮各洗3次，干燥，即得馬卡列丙精多糖。

2.2 多糖的水解

精密稱取上述馬卡列丙精多糖50 mg，置于10 mL水解管中，加入2 mol/L硫酸溶液2 mL，于100 ℃干燥箱中水解8 h，用4 mol/L氫氧化鈉溶液中和至pH約7.0，待衍生化。

2.3 對照品溶液的配制

稱取阿拉伯糖、甘露糖、無水葡萄糖和木糖約20 mg，精密稱定，置于10 mL的容量瓶中，用純化水定容，分別配制為2.03 μg/μL，2.05 μg/μL，2.08 μg/μL，2.06 μg/μL的對照品溶液。

2.4 對照品和樣品的衍生化

精密量取100 μL樣品水解液、100 μL四種對照品混合溶液作為混標及100 μL純化水置于不同的水解管中，分別加入100 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液及100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混合后在 70 ℃水浴中反應30 min，取出冷卻，加 100 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，再加水 1 mL，用1 mL氯仿萃取3次，棄去氯仿層，水層用0.45 μm微孔膜過濾后，進HPLC分析。

2.5 色譜條件

色譜柱:Thermo Scientieic BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：0.5%磷酸鹽緩沖液(A)和乙腈(B)梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL/min；檢測波長245 nm；進樣量：20 μL，柱溫：45 ℃。

表1 流動相梯度洗脫比例表

2.6 方法學的考察

2.6.1 線性關系的考察

分別精密量取甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖和木糖對照溶液適量，配成一系列濃度的混合標準品溶液。按“2.4”項下衍生化后，按“2.5”項下的色譜條件依法測定，各化合物以質量為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性分析，計算相關系數，結果見表2。

表2 回歸方程，線性關系和范圍

2.6.2 精密度實驗

精密吸取“2.3”項下混合對照品衍生溶液，連續進樣6次，每次 20 μL，分別記錄各成分峰面積并計算其RSD，測得甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的RSD分別為 0.14%，0.05%，0.04%，0.09%，表明儀器的精密度良好。

2.6.3 重復性實驗

取6份馬卡列丙多糖，按“2.2”項水解，按“2.4”項進行衍生化，按“2.5”項下色譜條件，進行樣品分析，測得甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的含量，計算RSD分別為：3.84%，2.24%，1.16%，3.44%，表明該方法重復性良好。

2.6.4 穩定性實驗

取“2.3”項中供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h進樣，按色譜條件，記錄峰面積，測得甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的RSD分別為：0.32%，0.58%，0.50%，0.48%，表明樣品在24 h內穩定。

2.6.5 加樣回收率實驗

表3 加樣回收率

取已知含量的馬卡列丙多糖樣品約50 mg，精密稱定，按“2.2”項方法水解，取100 μL水解液，平行6份，加入一定量的對照品溶液，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD。結果甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的平均加樣回收率分別為98.7%，98.1%，96.3%，104.4%，RSD分別為3.07%，2.45%，2.81%，2.44%，表明該方法的準確度良好，結果見表3。

2.6.6 多糖樣品組分分析和摩爾比

精密稱取馬卡列丙多糖，按“2.2”與“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.5”項下色譜條件，進HPLC分析，其色譜圖如圖1所示，結果表明馬卡列丙多糖中含有甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖，其摩爾比值約為0.10:3.87:1.00:0.07。

圖1 樣品色譜圖

3 討 論

3.1 多糖水解條件的考察

為了優化多糖的水解過程，本文對硫酸的用量(1, 2, 3 mL)，水解時間(7, 8, 9 h)和水解溫度(90, 100, 110 ℃)，進行了單因素考察。結果表明，隨著硫酸的用量增多、水解時間的增長、水解溫度的提高，各單糖峰面積逐漸增加，在硫酸用量為2 mL，水解時間為8 h，水解溫度為100 ℃時，各單糖的峰面積最大且穩定，與文獻報道的水解條件基本一致[11]，因此最終選定在上述條件下進行多糖的水解。

3.2 色譜條件的選擇

采用三種不同的色譜柱(Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)，Dikma Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Thermo Scientific Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，考察試樣品的分離情況，結果表明Thermo Scientific Hypersil BDS C18對對照品和供試品溶液的分離效果較好。為了進一步優化色譜條件，分別對流動相的種類(甲醇/水和乙腈/水)，流速(0.8，1.0，1.2 mL/min)，柱溫(25，30，35，40，45 ℃)以及梯度進行了考察，結果表明流速對色譜峰分離度影響不大，柱溫可改善分離度，并降低柱壓，因此最終，選擇梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為45 ℃的色譜條件進行色譜分離。

4 結 論

多糖是生物體內重要的生物大分子，具有抗腫瘤，增強免疫力等多種藥理作用，結構多由葡萄糖，甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖，巖藻糖等單糖組成。本研究建立了柱前衍生化測定侗藥馬卡列丙多糖中單糖組成的方法，該方法重現性良好，能夠快速對多糖樣品進行組成分析，為侗藥馬卡列丙的研究奠定基礎。