氣相串聯質譜法測定薄荷香精中二氫香豆素

2020-03-31 07:43:36林偉斌譚麗容張龍開

廣州化工 2020年5期

林偉斌，譚麗容，程敏，張龍開

(弘正道(中國)中藥研究有限公司，廣東廣州 510665)

香豆素類化合物是存在于蕓香科、傘形科、菊科、豆科、瑞香科、茄科等高等植物和動物及微生物代謝產物中的一類天然香料，在藥物及化妝品、清潔劑、除臭劑等日化產品的生產中常被用作香料從而廣泛使用[1]。為增加香氣或掩蓋不良氣味，生產企業通常會在日化產品中添加一定量的日用香精[2]，而日用香精的安全性與日化產品的安全性息息相關。據研究報道，較高濃度的香豆素類化合物在接觸皮膚后，可引起過敏反應；此外，口服攝入可對人體肝臟產生損傷[3-4]。

鑒于香豆素類化合物對人體健康的危害性，加拿大衛生局(Health Canada)將二氫香豆素列為禁用日化添加劑[5]。歐盟化妝品法規Regulation(EC)1223/2009[6]、我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)[7]、GB 22115-2008《牙膏用原料規范》[8]、GB/T 22731-2017《日用香精》[9]均明確禁止在化妝品或日化原料中加入二氫香豆素。食用香精，如薄荷香精，雖多以食品添加劑廣泛應用于各類食品中，但也常被添加到牙膏產品中[10]，故對其中禁用致敏成分二氫香豆素的監控具有一定的意義。

目前，關于香豆素類化合物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[11-14]、氣相色譜法(GC)[15]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[4,16-17]、氣相色譜-質譜法(GM-MS)[18-19]，但尚未見有使用氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)測定二氫香豆素的文獻報道。本研究建立了薄荷香精中二氫香豆素的氣相色譜-三重四級桿串聯質譜快速測定方法，既可以準確定量，亦可以定性，避免了假陽性結果的發生，方法準確、快速、簡便、無污染，為香精行業提供質控方法參考。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ 8000 EVO型氣相色譜-串聯質譜儀(配有EI源)，美國Thermo Fisher公司；TOLEDO電子天平，瑞士Mettler公司；ST16R離心機，美國Thermo Fisher公司；88880018型渦旋混合器，美國Thermo Fisher公司。

二氫香豆素(CAS號：119-84-6，純度≥99.0%)，上海安譜實驗科技股份有限公司；無水乙醇(色譜純)，德國Merk公司；無水硫酸鈉(分析純)，廣州化學試劑廠；市售薄荷香精，溶劑均為丙二醇。

1.2 標準儲備液及標準工作液的制備

稱取二氫香豆素標準品0.1 g(精確至0.1 mg)置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液。使用時以無水乙醇逐級稀釋成適宜濃度的混合標準溶液，均于4 ℃避光保存。

1.3 樣品處理

準確稱取薄荷香精0.2 g(精確到0.1 mg)，置于50 mL離心管中，精密加入10 mL無水乙醇，渦旋5 min，加入0.5 g無水硫酸鈉，渦旋3 min，4000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm 濾膜過濾后供GC-MS/MS測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：TG-1701MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氦氣，純度>99.999%；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣體積：1 μL；，進樣方式：不分流進樣，1 min后打開分流，分流比為50:1；升溫程序：初始溫度70 ℃保持1min，以5 ℃/min速率升至140 ℃，再以30 ℃/min速率升至280 ℃，保持10 min。二氫香豆素的色譜圖見圖1。

圖1 二氫香豆素的色譜圖

1.5 質譜條件

表1 二氫香豆素的質譜分析參數

*定量離子對。

電子轟擊離子源(EI)，電離能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，13 min溶劑延遲，采用多反應監測模式(SRM)進行離子檢測，二氫香豆素的監測離子對、碰撞能量見表1，帶*的子離子與其對應的母離子為定量離子對。質譜圖見圖2。

圖2 二氫香豆素的質譜圖

2 結果與討論

2.1 樣品處理方式的選擇

為了簡化前處理步驟并盡可能獲得好的提取效果，本研究采用渦旋震蕩的方式對樣品中二氫香豆素進行提取，分別考察了無水乙醇、二氯甲烷、正己烷、四氫呋喃等不同提取溶劑的提取效果。結果表明：無水乙醇、二氯甲烷和四氫呋喃均與香精的原有溶劑混溶度較好，可將目標物提取完全，而正己烷則與香精混合后出現分層現象，綜合考慮經濟性及安全性，選擇毒性小、在氣質上無干擾的無水乙醇為提取溶劑。此外，香精樣品中大多含有水、乙醇、丙二醇和丙三醇[19]，樣品中的水分對毛細管色譜柱和GC-MS/MS檢測器有較大的損害，故需要以無水硫酸鈉作為干燥劑，除去樣品溶液中的水分。

2.2 色譜柱的選擇

本研究在相同試驗條件下考察了TG-5MS，TG-1701MS，TG-WaxMS等不同極性色譜柱的分離效果，結果表明：二氫香豆素在三種色譜柱上分離效果均較好，色譜峰響應值較高，峰形尖銳，對稱性好，如圖3所示。但TG-WaxMS屬于強極性柱，最高使用溫度較低(250 ℃)，其固定液易流失，會對GC-MS/MS系統造成污染。另外，TG-5MS在分析香精樣品時存在干擾峰，故選擇TG-1701MS(最高使用溫度280 ℃)作為分析柱。

圖3 不同色譜柱分離得到的色譜圖

2.3 方法的線性范圍和檢出限、定量限

將二氫香豆素標準儲備液用無水乙醇稀釋成濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL的標準工作溶液，在確定的色譜及質譜條件下進行測定，以二氫香豆素的質量濃度為橫坐標X，以定量離子響應峰面積為縱坐標Y，擬合標準曲線得到線性回歸方程和相關系數。結果表明，二氫香豆素在0.0001～0.0100 mg/mL質量濃度范圍內擬合線性良好，相關系數為0.9995。

在空白樣品中添加低濃度目標物，按“1.3”所述樣品處理方法進行樣品前處理，上機檢測，以至少3倍和10倍信噪比(S/N)對應的濃度計算檢出限和定量限。二氫香豆素的方法檢出限(limits of detection, LOD)為0.5 mg/kg，定量限(limits of quantitation, LOQ)為1.5 mg/kg。二氫香豆素的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限以及定量限結果見表2。

表2 二氫香豆素的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限以及定量限

2.4 回收率與精密度

在空白基質樣品中加入二氫香豆素標準溶液，加標量分別為1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL，經GC-MS/MS分析后，根據加標量和測定值計算方法回收率。精密度實驗采用對相同標準品不同質控濃度，同等條件下重復分析6次，以相對標準偏差(relative standard deviation, RSDs)表示方法精密度，結果見表3。