固-液結合法合成布舍瑞林*

宋 蕓，鐘 霞，陳年根

(海南醫學院，海南省熱帶藥用植物研發重點實驗室，海南 ?？?571199)

布舍瑞林(Buserelin)是促性腺激素釋放激素(LH-RH)激動劑類似物，為人工合成的線性九肽，其氨基酸序列為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(焦谷氨酸-組氨酸-色氨酸-絲氨酸-酪氨酸-(O-叔丁基)-D-絲氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-乙胺基)?；瘜W結構式見圖1。

圖1 布舍瑞林的化學結構式

布舍瑞林劑型分為注射劑、鼻噴劑和植入劑三種，臨床用于治療前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜異位癥和子宮肌瘤等。目前，布舍瑞林原料藥及其制劑均未進入中國。

布舍瑞林的合成方法主要包括固相合成、液相合成和固-液結合合成三種方法。固相合成方法中[1-4]，保護氨基酸和縮合試劑需要三倍過量或更多，氨基酸浪費較多，合成成本大。并且在最后的切肽工序中，6-位絲氨酸側鏈叔丁基很容易在酸性條件下被脫除而生成其它雜質，反應收率較低。固相合成僅在最后一步進行純化工序，粗品的純度和肽含量均較低，給分離純化帶來很大的困難。

固-液結合合成布舍瑞林方法中，文獻[5]用固相方法合成三肽片段H-D-Ser(But)-Leu-Arg(HCl)-OH，而另一種方法[6]合成七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-OH，兩種方法均使用TFA/DCM 體系進行多肽從樹脂上切割。此多肽切割方法容易使6-位絲氨酸側鏈叔丁基脫除，降低反應收率，后續分離純化困難。

文獻[7]報道了全液相5+4片段縮合合成布舍瑞林方法，氨基酸的氨基采用了Fmoc保護方式，其脫除采用25%哌啶/DMF 溶液。哌啶屬于劇毒化學品，大量使用會造成嚴重的環境污染。

文獻[8]采用4+3+2液相片段縮合法。而文獻[9]采用(2+2)+(3+2)的液相片段合成策略。這兩種方法均采用疊氮化合物法進行肽片段的縮合，疊氮物法操作危險，需要零下40 ℃以下低溫，因此不適合產業化生產。

專利EP1008656[10]報道了另一種液相3+2+4合成布舍瑞林的方法，此方法的創新點在于使用了蛋白酶催化劑，但所得產物很難純化。

本文目的是為了克服現有合成路線的缺陷，提供一種保護氨基酸和縮合劑來源豐富、反應條件溫和、適合放大生產、收率高、純化簡便的布舍瑞林新合成方法，其合成路線如圖2所示。

圖2 布舍瑞林的合成路線

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

儀器：RP-HPLC型高效液相色譜儀，Waters公司；三重四極桿質譜儀，賽默飛世爾科技；Bruker ARX-400核磁共振波譜儀，瑞士Bruker；真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司。

試劑：pGlu、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Trp、Fmoc-Ser(But)、Fmoc-Tyr(Bzl)、Fmoc-D-Ser(But)、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(NO2)、Fmoc-Pro、2-Cl-Trt-樹脂、N-甲基嗎啉(DIEA)、1-羥基苯并三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC)，上海吉爾生化有限公司；三氟乙酸(TFA)，Sigma公司；乙腈、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、異丙醇和哌啶，北京百靈威化學試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 Fmoc-Ser(But)-OH和Fmoc-Pro-OH分別與2-Cl-Trt樹脂的連接

精確稱取2-Cl-Trt樹脂加入固相反應器中，并加入DMF浸泡30 min，而后依次加入Fmoc- Ser(But)-OH，苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N-羥基苯并三氮唑(HOBt)和4-二甲氨基哌啶(DMAP)，之后加入N-甲基嗎啉(NMM)調pH=7～8，氮氣吹拂，反應8 h。反應畢，將反應液抽干，然后用 DMF和二氯甲烷交替洗滌樹脂，抽干。

Fmoc-Pro-OH與2-Cl-Trt樹脂的連接采用上述相同的方法。

1.2.2 脫 Fmoc保護基

取體積分數為20%的 PIP(哌啶)/DMF溶液，加入Fmoc保護的氨基酸樹脂中，緩慢攪拌40 min。脫除反應結束后，將反應液抽干，然后用DMF和DCM交替洗滌樹脂至干凈為止。

1.2.3 接肽反應

取3倍量的保護氨基酸，HBTU和HOBt，加入固相反應器中，加 DMF 溶劑和NMM調節pH=7～8，氮氣吹拂，用Kaiser試劑監測反應進程。反應完成后，將反應液抽干，并用 DMF和DCM交替洗滌樹脂。

1.2.4 四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH 的合成

根據四肽的氨基酸序列，三倍量的Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu依次按照接肽反應方法與Ser(But)-2-Cl-Trt樹脂進行反應，得到全保護四肽樹脂(pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(But)-Resin)。洗滌干凈后向固相反應器中加入比例為TFA:TIS:H2O=95:5.0:2.5的切割液反應30 min，抽濾，濾液旋蒸得粘稠狀液體，傾入冰冷乙醚，有白色固體析出，固體經高壓制備純化得四肽純品。

1.2.5 五肽Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH的合成

依據五肽的氨基酸序列，依次加入Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(But)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH至Pro-2-Cl-Trt樹脂體系進行接肽反應。接肽反應完畢后洗滌，再用TFA/DCM=1%的切割液切割樹脂。旋蒸切割液，加入冷乙醚析出白色固體，收率為28.3%。

1.2.6 五肽Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成

稱取Fmoc-5t 0.41 g(0.39 mmol)加入到25 mL圓底燒瓶中，加入DMF 10 mL，冰浴下加入DIEA，調pH約為8，向其中加入DCC(1.96 mmol)，HOBT(1.96 mmol)，攪拌溶解，反應 5 min。準確量取乙胺0.13 mL(2.0 mmol)加入反應體系中，室溫攪拌，TLC監測反應進程，待Fmoc-5t消失后，將溶劑蒸除，加入乙醇，有白色固體析出，抽濾，真空干燥，收率為80.2%。

1.2.7 五肽Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成

將Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 0.26 g(0.25 mmol)置于圓底燒瓶中，加入PIP:DMF=20% 的溶液10 mL攪拌溶解，TLC監測反應。得0.18 g白色固體，收率91.3%。

1.2.8 五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

向裝有電磁攪拌的高壓反應釜中加入Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(4.8 g，5.0 mmol)，然后加入甲醇(100 mL)，攪拌至溶解，加入5% Pd/C(0.5 g)，氫氣置換空氣3次，于室溫和10 bar的壓力下反應2.0 h，反應畢。過濾，減壓蒸除溶劑，用高壓制備液相分離純化后得純品Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(2.5 g，收率75.4%)。

1.2.9 布舍瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

取pGlu-His-Trp-Ser-OH 8.3 g(15 mmol)，溶于50 mL DMF中，冰鹽浴下依次加入1.75 mL NMM，5.7 g HBTU和Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-Et 10.75 g(15 mmol)，補加NMM調節pH約為8，冰鹽浴攪拌40 min后轉至室溫繼續攪拌，高壓液相色譜監測反應程度。反應畢，減壓蒸除溶劑，殘留物用甲醇-乙酸乙酯重結晶得白色固體粗品13.8 g。

1.2.10 布舍瑞林的高壓制備液相分離純化及凍干

用乙腈/水(20/80)溶液溶解粗品，濃度為1.0 g/mL，用TFA調整溶液pH值3.0左右。使用直徑=300 mm、孔徑=0.45 μm 微孔濾膜過濾待用。制備柱：15 cm×30 cm柱，kromasil 10 μm C18反相色譜填料顆粒。流動相A：0.1% TFA水溶液；流動相B：90%乙腈/10%水/0.1%TFA，梯度洗脫，收集主峰組份。旋轉蒸除有機溶劑后，凍干得布舍瑞林純品，純度達98%。

2 結果與討論

2.1 產物表征

采用上述合成路線所得布舍瑞林，質譜圖中主峰顯示的分子質量為1240.1 ku(M+H)+(圖3)，與理論分子質量1038.66 ku基本吻合。經HPLC純度分析，其純度可達97%。主峰的保留時間與對照品完全一致，結合質譜結果，說明產物為布舍瑞林。

圖3 布舍瑞林的質譜結果

圖4 布舍瑞林的HPLC色譜圖

HPLC的色譜條件：4.6 mm×25 cm(C18)；流動相A液：1 mL/L三氟乙酸/水溶液，B液：1 mL/L三氟乙酸/乙腈溶液。梯度洗脫：900 mL/L A液+100 mL/L B液在35 min內降為100 mL/L A液+ 900 mL/L B液，檢測波長：220 nm，流速：1 mL/min。

2.2 四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH的固相合成

2.2.1 采用Fmoc-Trp-OH代替Fmoc-Trp(Boc)-OH可降低成本

表1 Fmoc-Trp-OH代替Fmoc-Trp(Boc)-OH的影響

比較了Fmoc-Trp(Boc)-OH和Fmoc-Trp-OH對四肽合成的影響，結果如表1所示。使用Fmoc-Trp-OH進行四肽合成，對粗品純度和收率的影響不大，但Fmoc-Trp-OH的分子量更小且價格更為便宜，因此可大大降低四肽的合成成本。

2.2.2 切割劑的選擇

當使用酸將肽鏈從樹脂上切除時，會產生碳正離子樹脂，同時一些側鏈保護基也會被酸解下來，產生側鏈保護基的碳正離子，如果這些碳正離子沒有及時被清除，就會被肽鏈中親核性強的基團進攻，形成副產物，因此，應該加入清除劑將碳正離子捕獲。本實驗對兩種清除劑乙二硫醇(EDT)和三異丙基硅烷(TIS)作用效果進行了比較，結果見表2。

表2 切割試劑的選擇

將乙醚吹干后，以EDT為清除劑的產品，性狀為粘稠狀，高壓制備液相后產率為28.3%，以TIS為清除劑的產品，得到白色固體，經高壓制備液相后產率為29.6%，兩者產率相差不大，但是由于EDT本身有惡臭的氣味，產物粘稠，因此最終選用TIS作為清除劑。

2.3 五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

2.3.1 樹脂的選擇

五肽的C末端氨基酸為Pro，其很容易產生哌嗪二酮，導致肽的產量降低。由于2-Cl-Trt樹脂2位Cl原子的空間位阻比較大，使其形成哌嗪二酮的幾率降低，因此本實驗采用2-Cl-Trt樹脂為固相載體。

2.3.2 4+5片段縮合合成布舍瑞林

本文考察了兩種4+5片段縮合合成布舍瑞林的方法。方法1：四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH與保護五肽Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 在縮合劑作用下先生成保護九肽，再催化氫化脫除側鏈保護基得布舍瑞林；方法2：先脫除五肽的側鏈保護基得Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt，然后與四肽反應得到布舍瑞林。實驗發現，采用方法1反應時間更長，收率低且產物復雜，很難純化。因此選擇方法2進行布舍瑞林的合成。

3 結 論

通過液相-固相結合的方法合成布舍瑞林，既簡化了純液相合成的繁瑣，縮短了反應時間，又避免了純固相合成中間過程難以控制，副產物多難以純化的缺點。