γ-kokumi肽及其合成酶γ-谷氨酰轉肽酶的研究進展

伍圓明，伍倫杰，王 莉，林 璐，劉 義，孫偉峰，丁文武,

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.衡陽師范學院生命科學與環境學院，湖南 衡陽 421008）

隨著生活質量水平的提高和個體飲食習慣的差異化發展，食品的味道和質量受到了越來越多的關注，人們對食物味道的需求不再局限于單一的基本味覺體驗，還更多地追求豐富的味覺體驗及幸福愉悅的味道，而使人感到回味無窮、濃郁持久和極富層次感的濃厚味（kokumi）能極大程度地滿足這一需求。因此，在食品調味品領域中，kokumi已然成為了一個研究熱點。

Kokumi是繼五大基本味覺酸、甜、苦、咸、鮮之后新提出的第6種基本味覺候選之一[1]，主要代表食物味道的濃厚感（thickness）、飽滿感（mouthfulness）、持續性（continuity）及協調性（harmony of taste）[2]。kokumi物質的特點是，當添加到基本的味道溶液或食物中時，它們會提升5 種基本口味的協調性和呈味強度（特別是鮮味）。目前已報道的kokumi物質多數為短肽類[3]，而在多項關于kokumi肽鑒定的研究中發現，發酵食物中濃厚味的主要貢獻者為γ-谷氨酰多肽（γ-kokumi肽）[4-11]并且與其他呈味分子，如寡糖、核苷酸等組合使用還能增強濃厚味、延長回味或提升鮮味強度，具有極大的開發價值和市場前景，因此，其生產應受到更多的關注。

γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）具有將γ-谷氨酰基轉移至受體分子上的特異性催化功能[12]，可直接催化合成γ-谷氨酰肽而受相關食品工業領域的廣泛重視，并且GGT已經成功應用于L-茶氨酸等重要γ-谷氨酰類化合物的生產中[13-16]，為γ-kokumi肽的酶法生產提供了有力的參考。

因此，本文對γ-kokumi肽結構特征、食物來源、呈味評價方法、制備方法及食品中的應用，以及GGT結構特征、轉肽反應催化機理及合成γ-kokumi肽的生產應用等方面進行了綜述，加深對γ-kokumi肽結構與呈味的關系、GGT結構與轉肽活性的關系以及GGT合成γ-kokumi肽的現狀等科學和工程問題的認識，以期為新型γ-kokumi肽的設計、γ-kokumi肽大規模生產和相關肽類增味產品的開發提供一定的參考。

1 γ-kokumi肽概況

1.1 γ-kokumi肽的結構及特征

γ-kokumi肽是具有kokumi特征的γ-谷氨酰肽，多為二肽或三肽。γ-谷氨酰肽分子結構如圖1a所示，谷氨酸在α-C和γ-C上都連接有—COO-基團，當谷氨酸的γ-COO-與γ-谷氨酰基受體（R基團）的NH3+脫水縮合形成γ位肽鍵時，即產生了γ-谷氨酰肽，其中R基團可以為多肽或者游離氨基酸。例如最常見的γ-kokumi肽為谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly，GSH），其結構由γ-谷氨酰基與二肽-Cys-Gly組成（圖1b）。

γ-kokumi肽的結構與其濃厚味強度密切相關。γ-kokumi肽N末端的γ-谷氨酰基是其呈濃厚味的關鍵基團，Yusuke等[18]篩選二肽庫發現大多數γ-谷氨酰基二肽（γ-Glu-X）具有濃厚味活性，而α-Glu-X幾乎都無濃厚味活性，三肽中也有類似的結論。γ-kokumi肽中間殘基和C-末端同樣對其濃厚味具有重要影響，當中間殘基為中等大小的不帶電、非極性脂肪族殘基時（如Val、Leu等），表現出更高的濃厚味強度；C-末端殘基的結構對其呈味影響相對較小，但其優選為無側鏈的Gly時，可進一步提升γ-kokumi肽濃厚味[18-19]。此外，殘基的側鏈中有含硫基團也有助于提升γ-kokumi肽濃厚味強度[19]。這些關于肽結構與呈味的關系的結論將為新型γ-kokumi肽的設計提供新的思路。

圖 1 γ-谷氨酰肽（a）及谷胱甘肽（b）[17]分子結構式Fig. 1 Molecular structures of γ-glutamyl peptides (a) and glutathione (b)[17]

1.2 γ-kokumi肽的來源

目前，大多數的γ-kokumi肽都是從常見的發酵食品、調味品或海鮮產品中分離鑒定獲得（表1）。1990年，Ueda等[20]從大蒜中分離獲得賦予濃厚味的物質，鑒定結果表明大蒜中濃厚味的主要貢獻者為γ-谷氨酰肽，包括GSH和γ-谷氨酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸（γ-Glu-S-allyl-Cys）等。隨后，Ueda等[21]又從洋蔥中分離鑒定出新的濃厚味物質γ-谷氨酰基-S-(1-丙烯基)-半胱氨酸亞砜。近年來，對菜豆[4]、Gouda干酪[22]等存在kokumi味道的成分分析發現，γ-kokumi肽物質是其主要的味道提供者。Kuroda[6,23-24]和Miyamura[7,25-26]等陸續在商業魚醬、加工扇貝、醬油、釀造酒精飲料等食品中檢測鑒定獲得一種典型的γ-kokumi肽——γ-Glu-Val-Gly，并指出該肽對發酵食品感官品質具有顯著影響[27]；后續的食品增味實驗結果也表明，γ-Glu-Val-Gly添加到低脂食品或雞肉清湯中能明顯提升其味道的飽滿感和持續性[9,27]。Zhao等[28]也在發酵的酸面團中鑒定出6 種γ-kokumi肽（表1），這些肽是面團濃厚感味的關鍵成分。最近，研究人員逐漸開始關注γ-kokumi肽的酶法合成，Yang Juan等[29-30]通過生物酶催化方法合成了多種系列的γ-kokumi肽，分別有γ-[Glu](n=1,2,3,4,5)-Phe、γ-[Glu](n=2,3,4)-Val和γ-[Glu](n=2,3,4)-Met，這些γ-kokumi肽都展現出濃厚的味道，并且能有效增強醬油的鮮味和連續性，以及雞肉清湯的濃厚感和飽滿感。

越來越多的γ-kokumi肽從不同的風味食物中被鑒定獲得，并陸續地被驗證能賦予食物濃厚感、飽滿感、持續性等口感特性，展現出非常強的增味能力；因此，γ-kokumi肽具有進一步開發成相關肽類食品風味增強劑的巨大潛力。

表 1 γ-kokumi肽的序列及來源Table 1 Sequences and sources of γ-kokumi peptides

1.3 γ-kokumi肽的呈味評價方法

目前對γ-kokumi肽的呈味評價方法通常為感官評價法和鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）活性檢測法。

感官評價法因簡便、迅速、準確分析樣品的優點，被廣泛用作于呈味肽呈味效果的測定[36]。γ-kokumi肽的感官評價測定不同于基本味覺酸、甜、苦、咸、鮮肽的測定方式，原因在于自身的水溶液基本上不存在味道或者呈味效果較低，但是只需要少量添加至鮮味物質（如谷氨酸鈉）中，即可顯著降低其鮮味閾值并提升鮮味溶液的連續性和口感。因此在采用感官評價法評價γ-kokumi肽的閾值時，將實驗品按照一定濃度梯度稀釋添加到基本的酸、甜、苦、咸、鮮的感官標準的單一溶液或者是混合液，按照一定標準進行打分，再根據統計學分析得出最終的感官評價結果。但是由于kokumi味物質的呈味的復雜性，使用感官評價法難以滿足定量準確的檢測，因此需要尋找更精確的檢測方式。

近年來，CaSR活性檢測法作為一種新型γ-kokumi肽的檢測方法逐漸受到學者的關注[37-38]。CaSR作為人體感知kokumi物質受體，與基本味覺的受體有味覺信號功能偶聯性。Brennan等[39]對kokumi類物質的信號傳遞做出以下猜想：CaSR在接收到kokumi物質受體時，接收刺激釋放Ca2+增加胞內濃度，產生一系列的味覺信號傳導，如增加ATP釋放加強接收鮮味物質的信號，從而達到降低鮮味物質閾值的效果。Ohsu等[38]合成一系列γ-谷氨酰肽，采用CaSR結合感官評價檢測法檢測kokumi呈味效果，結果表明經過感官驗證確定的γ-kokumi肽均能激活CaSR，且呈味閾值的高低與激活CaSR的激活力密切相關。后來，Yusuke[18]和Kuroda[40]等進一步研究了CaSR的感應機制，檢測了一系列人工合成的γ-kokumi肽，結合感官評價驗證，發現γ-kokumi肽的閾值越低，刺激CaSR釋放Ca2+的能力越強。由此表明CaSR活性檢測法可作為一種新型γ-kokumi肽的檢測方式。但是CaSR方法檢測存在一定局限性，因為CaSR易受到某些陽離子、堿性肽類和多胺類物質的刺激釋放Ca2+導致檢測結果的不準確性[41-42]。因此CaSR活性檢測法通常是與感官評價法共同使用對kokumi物質進行檢測。

1.4 γ-kokumi肽的制備

盡管γ-kokumi肽具有非常強的增味功能，但是市場上γ-kokumi肽類食物增味劑非常少，僅有GSH或富含GSH的酵母提取物成功商業化并用于增強食物的濃厚味[43-45]，其中最重要的一個原因是γ-kokumi肽的大規模生產能力較低。目前制備γ-kokumi肽方法主要有化學合成、微生物發酵和酶法合成。

化學合成法以簡單底物作為原料進行合成γ-kokumi肽，例如Yusuke等[18]通過N-α-芐氧羰基保護γ-谷氨酰基并逐個地將Glu、Val、Gly殘基縮合到主鏈制備γ-Glu-Val-Gly，最終得率為54%，但化學合成由于反應途徑長、基團修飾操作復雜、成本高、化學物毒性等問題，不適用于γ-kokumi肽的工業化水平大規模生產。由于當前大部分γ-kokumi肽來源于發酵風味食品，傳統的微生物發酵也是獲得γ-kokumi肽濃厚味物質有效選擇之一。然而目前常見的發酵風味食品都是傳統的固態發酵，存在時間長、產量低、純化難，工業化難度較高等問題，僅有少許γ-kokumi肽，如GSH通過液態發酵實現了大規模生產，且優化發酵工藝提高了其產量[46]，但產物分離純化難等問題亟待解決。酶法合成是通過生物酶催化合成γ-kokumi肽。文獻中已報道的酶主要有兩種：1）谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）。該酶具有一定的γ-谷氨酰基轉移活性[47-48]，有少數學者通過谷氨酰胺酶合成γ-kokumi肽，用于提升食物風味[29-30,49]。但谷氨酰胺酶受體的底物特異性較差，γ-谷氨酰基轉移活性較低，難以用于γ-kokumi肽的工業化生產。2）GGT。GGT屬于轉移酶而不是合成酶，它不需要ATP等能量來源，并且酶活力較高，具有大規模生產γ-kokumi肽的應用前景。關于GGT轉肽催化生產重要γ-谷氨酰類化合物如：L-茶氨酸、γ-谷氨酰-多巴等[13-15]的研究已經比較成熟，為GGT催化生產γ-kokumi肽提供了強有力的參考。

綜上所述，在γ-kokumi肽的制備中，由于化學合成的步驟復雜、成本高以及傳統發酵法的產量低、純度低等缺點，酶法合成被視為一種有效的、低成本的生產手段。其中，GGT因具有較強的轉肽活性而在γ-谷氨酰類化合物的合成中備受重視，使用GGT生產γ-kokumi肽將有效促進γ-kokumi肽的生產及在食品調味中的應用。

2 γ-kokumi肽合成酶GGT

2.1 GGT的來源及結構分析

GGT也稱“谷氨酰基轉移酶”或“谷酰轉肽酶”，從20世紀中葉開始，人們從細菌、植物、動物中相繼發現GGT，如奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，Pm）GGT[50]、大腸桿菌（Escherichia coli，Ec）GGT[51]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）GGT[52]、幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HpGGT）[53]、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，Bl）GGT[54]和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，Ba）GGT[55]、洋蔥和老鼠、牛、馬、人（human GGT，HGGT）的肝、腎、胰提取物等[50,56]。GGT在原核生物和真核生物的分布情況具有一定的差異性，真核生物中GGT定位于細胞膜，原核生物中則分布在周質空間或者被分泌到細胞外[57-58]。正是由于這種分布的差異性，原核生物來源的GGT更便于提取和純化，因此在工業生產中主要采用原核來源的GGT進行生產γ-谷氨酰基化合物，如采用EcGGT酶法合成γ-谷氨酰類化合物茶氨酸[51,59]，或將BsGGT添加到“moromi”半固態發酵發酵液中可提升成品的醇厚滋味感[60]。

隨著科學技術的發展，蛋白質結晶技術得到了全新的突破，蛋白質結構解析的分辨率越來越高，有助于深入理解蛋白結構和功能之間的關系。近年來，多個研究團隊解析了不同來源的GGT晶體結構，以期從接近原子水平的精密結構解釋其生化特性存在的差異性。對蛋白質結構數據庫中的GGT序列比對（圖2）和結構比對（圖3）分析發現，根據活性中心區域空間構象的不同可以分成兩類。

第一類為帶有“活性開關裝置”活性中心的GGT，如HGGT（PDB：4Z9O）[61]、HpGGT（PDB：2QM6）[62]、EcGGT（PDB：2DBU）[63]等。以EcGGT活性中心結構為例（圖3a），其活性中心是一個有“封口的口袋”，該結構的形成是由于：GGT自裂解催化過程中，位于活性中心的EcGGT的大亞基C端末尾氨基酸（第375～390位）圍繞Ile378發生偏轉，并遠離小亞基N端Thr 30?以上。空出來的區域形成一個能夠接受γ-谷氨酰化合物的活性口袋，并且活性口袋的上方存在大部分真核細胞中才會存在的“蓋子-突環”結構（lid-loop）[64]，該loop結構柔性較大，形成一個活性開關裝置，控制著底物和產物進出的速率。第二類為“開放式”活性中心GGT，如BsGGT（PDB：3A75）[64]和BlGGT（PDB：4OTT）（圖3b）[65]等。與第一類GGT活性中心區別在于，這類GGT在自在酶自成熟的過程中大亞基的C端末尾在成熟前后沒有發生偏移構象的改變，位于小亞基的N端附近，并且在活性中心上方不存在lid-loop結構，從而形成開放式的活性中心結構。

圖 2 不同來源GGT序列比對[50-55,61]Fig. 2 Alignment of GGT sequences from different sources[50-55,61]

圖 3 EcGGT（a）[63]和BlGGT（b）[65]的三維結構差異Fig. 3 Three-dimensional structural differences between EcGGT (a) and BlGGT (b)

對GGT活性中心及周邊區域分析發現，存在活性中心上方的lid-loop結構起著隔離活性中心和外部環境的作用，在酶催化反應過程中作為底物和產物進出的開關[62]。而控制lid-loop結構靈活的關鍵性氨基酸為蓋環頂點處的芳香族氨基酸[62,66]。原核生物以EcGGT為例（圖4a），lid-loop上保守的Tyr444上的酚羥基與保守的Asn411的側鏈酰胺官能團形成氫鍵保持lid-loop的空間位置，從而起到保護活性中心的功能[67]。而HGGT的酶活力高于原核生物來源的GGT，原因在于lid-loop中心處EcGGT Tyr444所對應的氨基酸殘基為Phe433，該殘基不存在酚羥基，因此不能形成氫鍵（圖4b），這樣增加了lid-loop的靈活性，有利于底物的進入和產物的釋放[68]。Terzyan等[61]對HGGT進行結晶進一步證明HGGT不含上述可以固定lid-loop結構的氫鍵（圖4b），從而導致HGGT的lid-loop柔性較高，具有有高遷移率。Calvio等[69]也對lid-loop結構的作用進行進一步探究，將EcGGT上的lid-loop結構通過基因設計到BsGGT中，在突變體BsGGT催化反應過程中，lid-loop結構展現出優先允許小分子γ-谷氨酰底物進入酶的活性中心而大分子后進入的調控功能，并且突變過后BsGGT的酶活力和穩定性比原酶顯著提升，酶穩定性增高的原因可能是lid-loop結構對活性中心有一定的保護作用。以上的研究發現有助于選擇用于生產γ-kokumi肽及其他γ-谷氨酰化合物為目的產物的GGT，還為設計具有高酶活力的突變體GGT提供一定參考意見。

圖 4 EcGGT（a）[63]和HGGT（b）[61]的lid-loop結構差異Fig. 4 Lid-loop structural differences between EcGGT (a)[63]and HGGT (b)[61]

2.2 GGT的成熟機制

圖 5 EcGGT自催化剪切過程[63]Fig. 5 Autocatalytic cleavage process of EcGGT[63]

GGT屬于N末端親核水解酶家族的成員之一，這類酶家族成員的共同特點是：轉錄翻譯生成的前體蛋白沒有酶活力，需要激活N端的Ser或者是Thr進行自催化裂解后才能產相應生酶活力，稱為自催化裂解成熟機制[63,70-71]。在GGT的自催化裂解過程中，其關鍵氨基酸為小亞基N端高度保守的Thr[63,72]。Okada等[63,73]使用Ala將EcGGT小亞基N端Thr取代，獲得的突變體T391A在形成二聚體過后沒有酶活力，Pica[74]、Murty[75]、Kristin[76]等采用類似的方法對BlGGT、BsGGT等不同來源的GGT進行突變驗證，也得到相同的結果。以上研究表明小亞基N端的Thr對GGT自催化裂解反應起著關鍵性的作用。GGT自催化裂解具體過程如圖5所示，GGT基因首先通過轉錄翻譯形成前體蛋白，小亞基N端的Thr作為親核試劑進攻大亞基C端的羰基形成過渡狀態的四面體中間體，Thr上的氨基通過質子化裂解C—N形成酯中間體，最后細胞基質中的水作為活性劑進攻中間體的羰基，前體蛋白裂解成為二聚體。二聚體的大亞基分子質量通常為38～72 kDa，小亞基的分子質量為20～66 kDa。

2.3 GGT的催化機理

小亞基N端高度保守的Thr不僅是GGT前體蛋白自催化裂解成熟的關鍵氨基酸，也是GGT催化反應中進攻底物的關鍵催化位點。GGT在催化反應屬于乒乓反應機制，分為酰化反應和去酰反應兩個步驟（圖6）[72,77-79]。酰化反應：首先是γ-谷氨酰底物進入GGT的活性中心，GGT小亞基N端上的Thr羥基氧原子親核進攻底物上γ-谷氨酰的羰基肽，形成γ-谷氨酰基-GGT中間體[80]；去酰化反應[12]：水、氨基酸或者多肽類（一般為二肽或者三肽）等作為親核試劑物質進入GGT活性中心進攻γ-谷氨酰基-GGT四面體中間體的羰基，中間體鍵斷裂從而生成新的γ-谷氨酰基化合物。根據去酰化親和試劑的種類不同分為水解反應、轉肽反應和自轉肽反應。GGT反應類型與所處環境的pH值密切相關相關，水解反應在酸性或者中性條件下進行，而轉肽反應在堿性條件下進行。

圖 6 GGT的催化機理及反應類型[63]Fig. 6 Catalytic mechanism and reaction type of GGT[63]

2.4 GGT轉肽反應的應用

目前已有報道表明，使用GGT可成功催化生產多種γ-谷氨酰類化合物，如：L-茶氨酸、γ-谷氨酰-多巴等[13-15]，但是GGT在堿性條件下極易發生不可逆的變性失活，限制其在實際生產中的應用。彭清等[15]發現GGT在高pH值下容易失活的原因是亞基解聚導致活性中心構象發生改變[81]，為穩定GGT的亞基結構，在遠離酶活性中心的亞基表面選擇合適的位點進行改造，增強亞基的疏水性能，最終得到穩定性較強的突變酶Y280V比原酶在高pH值下活力提高至58%以上。Keillor[12]及Carlo[82]等發現GGT在堿性條下進行轉肽反應時，自轉肽反應也存在，這導致得到的產物產量和純度較低。因此，在GGT工程化方面，如何降低自轉肽反應的發生以及提高轉肽反應效率從而提高產物量是當前亟待解決的重要問題。

最近，Lin Longliu[65]、Lin Minguan[83]等發現來源于地衣芽孢桿菌的BlGGT轉肽酶活力較高，對其活性口袋中的關鍵位點和周圍的氨基酸空間結構進行分析（圖7），發現BlGGT活性中心結構由周圍殘基形成的氫鍵網絡所固定，其中，構成氫鍵網絡的保守殘基Asn450對活性中心的穩定具有重要影響，對該點活性改造設計得到的突變體N450D不僅明顯提高轉肽反應的催化能力，還將轉肽反應/水解反應比例從3.5最高提升到18。Bindal等[84]對Arg109的定點突變研究發現，其帶正電荷的側鏈基團對底物的結合和自轉肽催化至關重要，突變體R109K自轉肽反應的活性降低，轉肽反應合成茶氨酸效率得到了明顯的提高。Pica[74]、Nakajima[85]和Chi Mengchun[86]等則對Arg109在BlGGT活性中心的具體作用進行了研究，改造與活性中心Arg109側鏈相互作用的Gly482和Gly482，酶的整體構象幾乎沒有發生改變，但是活性中心的Arg109空間位置發生較大偏移從而導致對酶活性產生了影響。由于GGT催化的相似性，其他來源的GGT可參考上述結果進行酶工程改造以提高轉肽活性和降低自轉肽反應活性，為生產γ-kokumi肽提供良好的酶催化劑。

圖 7 BlGGT活性中心的關鍵殘基[65,74,83-84,86]Fig. 7 Key residues in the active center of BlGGT[65,74,83-84,86]

3 GGT合成γ-kokumi肽的應用

3.1 GGT合成γ-kokumi肽的優勢

GGT具有獨特轉肽催化特性，對于γ-谷氨酰類化合物特別是γ-kokumi肽的工業化生產非常有意義。相較于其他合成方法，使用GGT作為生物酶催化劑生產γ-kokumi肽具有多方面的優勢[87]：1）和化學合成法相比，GGT催化合成無需對氨基酸或其他活性基團進行基團保護和去保護操作，酶僅同γ-谷氨酰基供體和受體相互作用，反應過程簡單；2）GGT屬于轉移酶而不是合成酶，進行催化時不需要ATP、金屬陽離子等能量物質或輔助因子；3）GGT對γ-谷氨酰基受體的底物特異性非常廣泛，添加不同的受體即可生成相應的γ-谷氨酰類化合物；4）細菌來源的GGT以未糖基化修飾的可溶性蛋白形式存在于細胞的周質空間或胞外，因此細菌來源的GGT比較容易獲得；5）不同于哺乳動物來源的GGT，細菌來源的GGT轉肽催化時能使用較廉價的γ-谷氨酰基供體，如谷氨酰胺等，可有效地降低生產成本。

3.2 GGT合成γ-kokumi肽實際應用

在21世紀之前，γ-谷氨酰肽的kokumi味性質未被廣泛了解，GGT曾作為一種風味改善酶進行研究，證實該酶可改善食物的整體風味并能減弱苦味氨基酸的苦味[35,88-89]。近10 年來，對于GGT合成γ-kokumi肽并改善食品風味的可行性研究報道逐漸增多。2009年，Toelstede等[5]研究證明青霉菌（Penicillium roqueforti）來源的GGT直接參與了藍色脈紋奶酪中γ-kokumi肽的合成，對奶酪的濃厚味具有重要的貢獻作用。Hillmann等[10]也證實牛奶原料中的GGT是帕瑪森芝士成熟過程中濃厚味物質——γ-kokumi二肽形成的關鍵因素。類似地，van Ho等[60]在日本發酵豆醬中添加BsGGT合成γ-kokumi肽以提升豆醬的濃厚感味，結果表明γ-Glu-Val和γ-Glu-Val-Gly兩種γ-kokumi肽濃度分別提高到70 μmol/L和16 μmol/L，同時提升了產品的鮮味，增強了豆醬的風味。

GGT催化合成γ-kokumi肽的能力得到驗證后，研究人員逐步開始通過添加特異性γ-谷氨酰基受體的方式用GGT催化合成特定的γ-kokumi肽。Suzuki等[35]以細菌來源的GGT為生物催化劑合成γ-Glu-Phe，在Gln和Phe濃度200 mmol/L、酶活力0.5 U/mL、pH 10.4及溫度37 ℃的條件下反應1.5 h，最終γ-Glu-Phe的產率為70%，遠高于化學合成；隨后，Suzuki等[33]按照同樣的方法，優化反應條件后，GGT催化合成γ-Glu-Val的產率高達88%。2012年，Speranza等[31]通過添加不同受體的方式成功合成了γ-Glu-S-allyl-Cys和γ-Glu-Met及其衍生物，但γ-kokumi肽的產率較低，可能的原因是該實驗中GGT來源于馬腎，轉肽反應活性較低。近些年，Lee[34]、Chi Mengchun[86]、Chen Yiyu[90]等使用BlGGT逐步合成了γ-Glu-S-allyl-Cys、γ-Glu-Phe和γ-Glu-Leu 3 種γ-kokumi肽，并通過條件優化提高這些肽的產量；值得注意的是，該團隊還研究了BlGGT的固定化催化應用[91]，通過共價鍵或非共價鍵的方式將BlGGT固定在氧化石墨烯納米片上催化合成γ-Glu-Phe和γ-Glu-Leu，最終產物收率都超過31%，其中共價固定的GGT在30 d的儲存期間具有與游離酶相當的酶穩定性，可以循環催化9 次，9 次使用后其酶活力約為初始酶活力的45.3%。另外，Suzuki等[92]創新性地將谷氨酰胺酶和GGT組成雙酶合成系統，添加到麥麩和大豆蛋白后高效進行γ-谷氨酰物水解反應和轉肽反應，最終生產獲得濃厚味較強的增味劑。總地來說，由于GGT具有以上諸多優點，利用GGT催化是合成γ-kokumi肽的一種有效的、低成本的生產手段，并且結合酶工程改造、酶固定化催化及雙酶合成系統等工程化策略能有效提高GGT生產能力，并降低生產成本，有助于酶法合成γ-kokumi肽的工業化生產。

4 結 語

前期關于γ-kokumi肽結構特征、調味應用及酶法合成的研究取得了很大的進步，但仍然有許多科學及工程等各方面的問題值得進一步研究。1）γ-kokumi肽的穩定性和安全性。由于γ-kokumi肽的目標是開發相關肽類增味劑，在產品貯藏、消費以及食用過程中其穩定性和安全性應得到高度重視，相配套的食品準入門檻和定性、定量分析檢測標準也需同步進行探索和研究。2）γ-kokumi肽的三維構象特征。關于γ-kokumi肽二級結構與呈味的關系研究已經取得了較大的進展，但更為重要的三維構象特征未被清楚認識，而γ-kokumi肽正是因為特殊的三維構象才能激活kokumi受體并傳遞信號，產生濃厚味；因此，應加強基于kokumi受體的γ-kokumi肽三維結構特征分析，從分子層面理解γ-kokumi肽呈味機制，也為新型γ-kokumi肽的設計和挖掘提供參考。3）GGT合成γ-kokumi肽的效率和產量還有待提高。目前文獻已報道的GGT催化合成γ-kokumi肽幾乎都處于實驗室級生產水平，還未找到同時滿足高轉化率、高產量、高強度的GGT，后續的研究可以通過篩選高活性的GGT和GGT酶工程改造，或結合液態發酵、固定化酶等工程化策略提高γ-kokumi肽的合成效率和強度，同時加強生產工藝的研究提高其產量，為γ-kokumi肽低成本、高產量的工業化生產提供基礎。

雖然國內對于γ-kokumi肽的研究起步較晚，但也有多個優秀的研究團隊在開展相關工作，隨著多方面問題的深入研究，會有更多的濃厚味增味劑出現在餐桌上，為我們創造更綠色、健康、美味的幸福生活。