載鋅與ε-聚賴氨酸抗菌膜的制備及其抗菌、物理性能研究

汪 慧，吳 旻，趙瑜婕，顧小煉，張鑫利，常 超,2,，伍金娥,2,

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，農產品加工與轉化湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430023）

食品在保藏的過程中易腐敗，其腐敗的主要因素在于微生物生長。目前，我國多數利用聚丙烯、聚乙烯、聚酯等材料加工合成食品包裝膜[1]。這些材料制成的包裝膜雖然加工過程方便、成本低，對食品的保鮮有重要作用，能夠很好地隔離外界環境以及微生物對食品的污染；但由于其材料的不可降解，使得環境被污染。因此，開發新型天然的可降解可食性保鮮膜將是一個十分具有前景的研究領域。

20世紀80年代，日本學者初次發現ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）對細菌、真菌的生長繁殖都有明顯的抑制作用[2]。ε-PL是一種由賴氨酸單體分子α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵而連接成的均聚氨基酸[3]。這類直鏈多聚體約由20～30 個賴氨酸殘基組成，由一類白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）代謝產生[4-5]，具有安全無毒、廣譜抑菌性、水溶性好、熱穩定性好等優點，此外，ε-PL在日用化妝品工業、基因載體、藥物制劑等領域也有廣闊應用[6-7]。目前我國已經批準ε-PL作為食品防腐劑應用于焙烤制品、熟肉制品以及果蔬汁生產中[8]。傳統的補鋅制劑主要是硫酸鋅，而新型有機補鋅制劑主要是葡萄糖酸鋅（zinc gluconate，ZG）。和傳統的補鋅制劑硫酸鋅相比，ZG具有吸收速率快、安全性高、利用率高等優點[9]。另外，ZG常常作為人和動物的補鋅制劑，在醫學臨床領域也發揮極其重要的作用[10]。海藻酸鈉、阿拉伯膠和甘油無毒，對人體無害，是可食性材料，可用于制備食品保鮮、綠色環保、可食用的包裝膜[11-12]。ε-PL用于可食性抗菌膜的制備已有不少文獻報道，余作龍等[13]以豌豆淀粉/ε-PL為主要基材，以甘油、海藻酸鈉等為增塑劑制備了復合膜包裝材料；柏韻等[14]研究發現，利用殼聚糖、ε-PL和卡拉膠對中國對蝦進行復合涂膜能夠抑制其貯藏期間細菌的生長；吳海霜等[15]利用ε-PL-殼聚糖/聚乙烯復合膜對鮮切茄子進行真空包裝。但目前鮮見將ε-PL與ZG復合的抗菌膜，本研究以海藻酸鈉、阿拉伯膠和甘油制備基礎膜，以ε-PL、ZG為抗菌劑，制備出一種安全無毒、可食用的新型抗菌功能膜，并研究該復合膜的性質和探討其對生鮮肉微生物抑菌的效果，為食品工業合理利用保鮮膜提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）由武漢輕工大學食品微生物實驗室提供。

LB培養基：將10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、1 000 mL蒸餾水混合均勻，于121 ℃滅菌15 min，得到LB液體培養基，備用；LB固體培養基在LB液體培養基的基礎上加入培養基質量2%的瓊脂。

海藻酸鈉、甘油 國藥集團化學試劑有限公司；阿拉伯膠 億鑫生物科技有限公司；ε-PL、ZG、瓊脂粉武漢楚誠正茂科技工程有限公司；氯化鈉、酵母膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀 美國Enspire公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YXQ-LS-70A自動高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；UltraScan VIS臺式分光測色儀 上海信聯創作有限公司；S-3000N型掃描電子顯微鏡 上海上天精密儀器有限公司；RGD-1型電子拉力試驗機深圳市瑞格爾儀器有限公司；數字測微計 深圳新德亞精密儀器有限公司；物性儀 英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL與ZG最適復配質量濃度的確定

采用微量稀釋法測定ε-PL的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[16]。取兩塊無菌的96 孔板置于超凈臺上，將初始質量濃度為42 mg/mL的ε-PL溶液用無菌水倍比稀釋，分別將S. aureus和E.coli O157:H7兩種菌懸液調至相同濃度（106～107CFU/mL），分別取50 μL加入相對應的96 孔板中，混勻后置于37 ℃培養箱中培養24 h，利用酶標儀于600 nm波長處測定其OD值[17]，判定MIC。

結合上述ε-PL的1/2 MIC，采用微量稀釋法確定利用1/2 MIC ε-PL與ZG復配后，復配液對兩種食源性病原菌的最佳抑菌濃度。具體為：取兩塊無菌的96 孔板置于超凈工作臺上，將初始濃度為0.05 mol/L的無菌ZG溶液用無菌水倍比稀釋，分別將S. aureus和E. coli O157:H7兩種菌懸液配制相同濃度（106～107CFU/mL），分別取50 μL加入相對應的96 孔板，再加入ε-PL溶液使ε-PL的質量濃度為1/2 MIC。將96 孔板置于37 ℃培養箱中培養24 h，利用酶標儀于600 nm波長處測定其OD值，確定與1/2 MIC、ε-PL溶液復配后ZG溶液的MIC。

1.3.2 ZG與ε-PL協同抗菌的效果測定

為評價ZG與ε-PL協同抗菌的效果，設計4 個ZG濃度（0.15、0.6、2.5、10 mmol/L）、3 個ε-PL濃度（0.33、0.65、1.3 mg/mL）。將系列濃度的ε-PL、ZG以及菌液（S. aureus或E. coli O157:H7）分別加入對應的96 孔板中，混勻后放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，利用酶標儀于600 nm波長處測定OD值并且計算抑制率。空白對照組為用無菌水代替ZG和ε-PL溶液，其他成分與ZG與ε-PL聯用組一致。抑制率按公式（1）[18]計算。

式中：A1為空白對照組的OD值；A2為ZG與ε-PL聯用組的OD值。

1.3.3 膜的制備方法

每100 mL去離子水中加入2.5 g海藻酸鈉、1 g阿拉伯膠、甘油2 g，分散后在恒溫磁力攪抖器上攪抖至溶液成透明的膠體狀態，靜置至氣泡消失，即得基礎膜液。取20 g基礎膜液，加入適量的一定濃度的ZG、ε-PL溶液，攪抖使溶液混合均勻，超聲波破碎至氣泡消失，然后取15 g液體至直徑為9 cm的培養皿，涂膜，置于干燥箱中38～40 ℃干燥12 h后，起膜即得抗菌膜。

1.3.4 膜的抑菌圈實驗

將兩種受試菌分別涂布到不同的LB固體培養基上（菌液濃度為106～107CFU/mL），用打孔器在膜上打出同樣大小（直徑6 mm）的膜片備用，然后將膜片分別貼在均勻涂布了菌種的固體培養基的表面，將培養皿倒置培養于37 ℃恒溫箱中24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑的大小。

1.3.5 抗菌膜的物理性能測定

1.3.5.1 表面形態觀察

采用S-3000N型掃描電子顯微鏡觀察抗菌膜的表面形貌，樣品貼在樣品盤上進行表面真空噴金，然后進行拍照。

1.3.5.2 厚度的測定

膜的厚度使用數字測微計測量，數據精確到0.000 1 mm，進行5 次測量，記錄數據并且計算平均值。

1.3.5.3 水蒸氣透濕量的測定

膜的水蒸氣透濕量的測定參照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法 杯式法》方法進行。

1.3.5.4 阻氧性的測定

稱取10 g大豆油于250 mL錐形瓶中，用已經制備好的膜封口，并用石蠟進行密封；放置于60 ℃的烘箱中，在10 d后揭開膜測定油樣的過氧化值，并將錐形瓶口敞開的油樣作為對照。過氧化值的測定根據GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》進行。

1.3.5.5 色度的測定

膜的色度使用UltraScan VIS臺式分光測色儀進行測定，L值為亮度，a和b值為色度坐標，a值表示紅（+）綠（-）度，b值表示黃（+）藍（-）度[19-20]。

1.3.5.6 抗拉伸強度與斷裂伸長率的測定

用切紙機將膜剪成45 mm×25 mm的長條，膜的機械性能用物性儀測定，探頭型號為A/TG，有效拉伸長度設置為50 mm，測試速率為1.0 mm/s。抗拉伸強度為拉伸過程中膜斷裂時單位橫截面上的力，按公式（2）計算，斷裂伸長率按公式（3）計算。

式中：F為最大拉力/N；δ為膜的厚度/mm；d為膜樣的寬度/mm；L0為膜拉伸前的有效長度/mm；L1為膜斷裂時的長度/mm。

1.3.5.7 傅里葉變換紅外光譜的測定

采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）儀測定膜的紅外結構，使用KRS-5型ATR探頭，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.6 抗菌膜對生鮮肉微生物抑菌效果的評價

樣品分實驗組和對照組，實驗組和對照組分別用ε-PL/ZG復合抗菌膜和基礎膜包裹生鮮肉，在37 ℃恒溫箱中放置24 h后分別測定菌落總數，菌落總數按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》的方法測定。

1.4 數據處理和分析

利用Excel軟件整理數據并作圖，采用SPSS Statistic 17.0軟件對數據進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ε-PL與ZG最適復配質量濃度的確定

圖 1 不同質量濃度ε-PL對S. aureus和E. coli O157:H7生長的影響Fig. 1 Effect of ε-PL concentration on the growth of S. aureus and E. coli O157:H7

如圖1所示，ε-PL對S. aureus的抑制能力隨著其質量濃度的增加而增強，當ε-PL質量濃度超過2.60 mg/mL時，兩種菌液的OD600nm趨于平緩，并且培養液澄清透明，可確定ε-PL對S. aureus和E. coli O157:H7的MIC為2.60 mg/mL。

圖 2 ε-PL與ZG復配對S. aureus和E. coli O157:H7生長的影響Fig. 2 Combined effect of ε-PL and ZG on the growth of S. aureus and E. coli O157: H7

固定ε-PL的質量濃度為1/2 MIC（1.3 mg/mL），用不同濃度的ZG與之復配，觀察復合液對S. Aureus和E.coli O157:H7的抑制效果。由圖2可知，所配復合液對兩種菌的抑制效果基本保持一致，均隨著ZG濃度（0.01～0.39 mmol/L）的增加而增強；當ZG的濃度增加至0.39 mmol/L時，培養液澄清透明，再增大ZG濃度，OD600nm基本不變；因此，在溶液體系中與1.3 mg/mL ε-PL復配的ZG最適濃度為0.39 mmol/L，且ZG與ε-PL聯合使用的抑菌效果要強于單一的ε-PL。

2.2 ZG與ε-PL的協同抗菌效果

圖 3 ZG與ε-PL復配對E. coli O157:H7（A）和S. aureus（B）的抑制效果Fig. 3 Synergistic antibacterial activity of ZG and ε-PL on E. coli O157:H7 (A) and S. aureus (B)

由圖3可知，當ZG濃度低于10.00 mmol/L時，ZG與ε-PL聯合使用的抑菌效果要強于單一的ZG，具有協同抗菌效應，但ZG在高濃度（10 mmol/L）時，與ε-PL無協同抗菌效應，其原因是過高濃度的ZG抑制了細菌生長[21]。有研究表明，ε-PL具有10 個以上賴氨酸殘基，具有抑菌活性[5]，并且能破壞微生物細胞膜的正常結構，阻礙微生物體內的所有生物合成代謝過程，使細胞的物質、能量和信息傳遞中斷，導致細胞受損[22]。一方面，Zn2+可與細菌體內含—SH的酶發生作用，破壞細菌正常的新陳代謝，而導致細菌死亡[23]；另一方面，大多數細菌細胞膜帶負電荷，Zn2+的正電荷在靜電作用下可與細菌的細胞膜接觸，從而使細菌生長受阻或死亡[24]。當ZG與ε-PL結合時，呈現相互協同效應。

2.3 ε-PL/ZG抗菌膜的抗菌性能

以海藻酸鈉（2.5 g/100 mL）、阿拉伯膠（1 g/100 mL）、甘油（2 g/100 mL）與去離子水為基礎膜成分，固定ZG的濃度0.39 mmol/L，設計系列ε-PL質量濃度，制備8 組抗菌膜并進行抑菌圈實驗（表1）。

表 1 抗菌膜中ZG與ε-PL的配比濃度及其對抑菌圈直徑的影響Table 1 Diameters of inhibition zones of indictor strains when exposed to antibacterial films with different concentrations of ZG and ε-PL

由表1可知，基礎膜、僅添加1.3 mmol/L ε-PL的抗菌膜（A1）以及僅添加0.39 mmol/L ZG的抗菌膜（A2）均未出現明顯的抗菌效果，且膜上有部分細菌生長。當ε-PL質量濃度不小于2.6 mg/mL時，抗菌膜對E. coli和S. aureus產生了良好的抗菌效果，抑菌圈直徑隨著ε-PL質量濃度的增加而增大。綜上，后續實驗測定含2 mg/mL ε-PL、0.39 mmol/L ZG抗菌膜的物理指標并評價其抗菌效果。

2.4 ε-PL/ZG抗菌膜的物理性質

2.4.1 ε-PL/ZG膜的表面形態

通過電子掃描顯微鏡可以對復合膜的表面形貌進行分析，清晰地觀察到膜液共混體系內部各相的分散狀態以及相界面之間的結合情況，可對共混體系中組分的相容程度進行定性評價[25]。由圖4可知，基礎膜的表面較為粗糙，膜中交聯點分布不均勻，膜的結構也相對松散。而添加ε-PL/ZG的抗菌膜表面較為光滑平整，膜中交聯點分布得比較均勻，膜的結構更加緊密。這是因為在基礎膜液中加入ε-PL/ZG后，海藻酸鈉會和Zn2+發生交聯作用，使得膜中的交聯點分布比較均勻，膜分子間排列更緊致，從而使得膜的結構變得更加緊密。

圖 4 ε-PL/ZG抗菌膜（A）和基礎膜（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscopic images of the ε-PL/ZG antibacterial film (A) and control film (B)

2.4.2 ε-PL/ZG膜的厚度、水蒸氣透濕量與阻氧性

表 2 ε-PL/ZG膜的厚度與水蒸氣透濕量Table 2 Thickness and water vapor permeability of the ε-PL/ZG film

從表2可以看出，在相同成膜液量（15 g）的情況下，添加ZG和ε-PL對抗菌膜的厚度影響很小，但對其阻隔性（阻水性和阻氧性）產生了顯著影響，不同組別抗菌膜的厚度范圍為0.097 6～0.097 8 mm。影響膜的水蒸氣透濕量的因素主要是聚合物分子鏈間作用力和分子鏈間的自由體積兩個方面，分子鏈間作用力越小，分子鏈間的自由體積越大，膜的滲透性越大[26]，ε-PL/ZG膜的水蒸氣透濕量為3 633.75 g/（m2·d），小于基礎膜的水蒸氣透濕量，表明ε-PL/ZG膜具有較好的阻水性。無膜覆蓋的大豆油過氧化值為1.39 g/100 g，顯著高于有膜覆蓋油樣的過氧化值，表明海藻酸鈉基膜和復合膜均具有較好的阻氧作用。加入ε-PL/ZG后，膜的水蒸氣透濕量和氧氣透過量略有減小，可能是由于弱極性的ε-PL與海藻酸鈉分子之間的相互作用使膜分子間緊密排列，改善了膜對水蒸氣和氧氣的阻隔性。加入ε-PL/ZG后，海藻酸鈉會與溶液中的Zn2+發生交聯反應使得膜的結構變得更加緊密，使得膜的阻水性和阻氧性效果更好。

2.4.3 ε-PL/ZG膜的色度

表 3 ε-PL/ZG膜的色度參數Table 3 Color parameters of the ε-PL/ZG film

從表3可以看出，加入ZG和ε-PL后，抗菌膜的L值減小，而a的絕對值、b值均增大，說明與基礎膜相比，載鋅與ε-PL抗菌膜的亮度有所減弱，顏色變綠、變黃。這可能是因為加入的Zn2+與海藻酸鈉的聚合鏈的締合鏈段之間產生三維結構，從而使膜表面出現許多“孔洞”，ε-PL滲透于海藻酸鈉分子的間隙和所形成的“孔洞”中，由于ε-PL溶液本身為黃色，加入后會使膜的顏色加深，使得所測定的a和b值的絕對值增大[27]。

2.4.4 ε-PL/ZG膜的抗拉伸強度與斷裂伸長率

表 4 ε-PL/ZG膜的抗拉伸強度和斷裂伸長率Table 4 Tensile strength and elongation at break of the ε-PL/ZG film

抗菌膜力學性能的變化與其本身微觀網絡結構和分子間作用力有關[28]。由表4可知，在加入ZG溶液后，膜的抗拉伸強度和斷裂伸長率增大，其原因是海藻酸鈉會和溶液中的Zn2+發生交聯反應，膜中交聯點分布得比較均勻，使得膜的結構變得更加緊密。在加入ε-PL后，膜的抗拉伸強度和斷裂伸長率也增大，其原因可能是由于海藻酸鈉是線性多糖，其分子中的OH-和ε-PL的NH3+間發生相互作用形成網狀結構，使膜內分子結合更加緊密[29]。結果表明在膜液中添加ε-PL/ZG會在一定程度上提高膜的抗拉伸強度，對變形的抗力也增大，同時也提高了膜的斷裂伸長率，增大了膜的韌性。NH3+

2.4.5 ε-PL/ZG膜的FT-IR分析結果

圖 5 基礎膜（A）與ε-PL/ZG抗菌膜（B）的FT-IR圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of control film (A) and ε-PL/ZG antibacterial film (B)

通過FT-IR可鑒別化合物中的化學鍵類型[30]，由圖5可知，基礎膜中3 200～3 500 cm-1處出現寬峰，這屬于—OH伸縮振動峰[31]，與海藻酸鈉中含有羥基有關。2 960～2 850 cm-1處出現C—H的伸縮振動峰，是海藻酸鈉的特征峰；1 600 cm-1處出現的是C＝O的伸縮振動峰，是阿拉伯膠的特征峰[32]；1 036、1 413 cm-1處是C—O的彎曲振動峰。基礎膜中820 cm-1處出現的C—OH伸縮振動在ε-PL/ZG抗菌膜中稍微減弱，推測是ε-PL的氨基和海藻酸鈉分子中的羥基發生了交聯；并且加入ε-PL/ZG后，C＝O的伸縮振動峰發生位移，由1 600 cm-1處移至1 608 cm-1處，說明抗菌膜分子之間形成了較為強烈的相互作用，這些結果也佐證了抗菌膜機械性能的改善。

2.5 ε-PL/ZG抗菌膜對生鮮肉微生物抑菌效果

圖 6 ε-PL/ZG抗菌膜對鮮肉在37 ℃下貯藏24 h后菌落總數的影響Fig. 6 Changes in total bacterial counts in chilled pork wrapped with ε-PL/ZG antibacterial film after storage at 37 ℃ for 24 h

圖 7 不同處理組生鮮肉貯藏結束后的照片Fig. 7 Pictures of fresh meat with different treatment after storage

肉品腐敗變質的主要原因是細菌大量滋生導致蛋白質分解[33]。GB 4789.2—2016《食品安全國家標準菌落總數測定》將肉的鮮度按菌落總數分為3 個等級：一級鮮度的菌落總數低于1×104CFU/g，二級鮮度的菌落總數在1×104～1×106CFU/g之間，菌落總數高于1×106CFU/g時為變質肉。貯藏結束后，對照組菌落總數增加明顯，而用抗菌膜包裹的實驗組菌落總數遠遠低于對照組（圖6），同時抗菌膜包裹后鮮肉內部清晰可見（圖7），不影響視覺效果，表明載鋅與ε-PL的抗菌膜具有很好的殺菌效果和通透性。

3 結 論

本研究中，以海藻酸鈉（2.5 g/100 mL）、阿拉伯膠（1 g/100 mL）、甘油（2 g/100 mL）與去離子水為基礎膜成分，添加0.39 mmol/L ZG、2.60 mg/mL ε-PL制備的抗菌膜具有較好的抗菌效果。該抗菌膜厚度為0.097 6 mm、水蒸氣透濕量3 633.75 g/（m2·d），抗拉伸強度為10.75 MPa、斷裂伸長率為29.34%。添加ε-PL/ZG溶液，可使膜的結構變得更加緊密，增強膜的抗拉伸強度，增大膜的斷裂伸長率，減少膜的水蒸氣透濕量，該膜既能控制細菌的生長，還能補鋅，天然環保，在食品包裝領域具有廣闊的開發和應用前景。