酪蛋白糖基化對其胰蛋白酶消化物在免疫低下模型小鼠中免疫活性的影響

時 佳，劉宛寧，付 余，趙新淮,

（1.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715）

酪蛋白是含量最多的乳蛋白成分，并且是食品工業廣泛應用的蛋白質配料。近20 年來，為進一步提高酪蛋白的應用效果，科研人員通過物理、化學或生物等不同途徑修飾酪蛋白結構、改進其功能性質，糖基化是其中修飾技術之一。美拉德反應是蛋白質（提供氨基）和還原糖（提供羰基）之間的反應，可以導致蛋白質發生糖基化。研究發現，利用美拉德反應和蘑菇β-葡聚糖對燕麥分離蛋白進行糖基化修飾，修飾后燕麥分離蛋白的溶解性、乳化性和熱穩定性得到改善[1]。葡聚糖和乳清分離蛋白經美拉德反應糖基化后，蛋白質分子間相互作用降低，在較大pH值范圍內和較高濃度下有較好的溶解性和熱穩定性[2]。利用美拉德反應分別和葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖糖基化得到糖基化β-乳球蛋白，其乳化和起泡性質均得到改善，并且這些性質的改善程度與糖種類有關[3]。蛋白質糖基化反應對蛋白質的某些生物活性也有影響。例如，葡萄糖糖基化的豌豆7S球蛋白有更低的抗體親和性和較低的Caco-2單層細胞毒性[4]；乳糖糖基化的酪蛋白具有較低的免疫活性[5]。作為重要的營養素之一，蛋白質對動物機體的免疫狀況有直接影響，可以促進免疫器官發育、淋巴細胞增殖，以及降低遲發性過敏反應[6–8]。然而，在免疫低下小鼠模型中，美拉德糖基化反應對酪蛋白消化物的免疫增強作用是否有影響的相關研究鮮見報道。

環磷酰胺是一種細胞毒性化療藥物，屬于烷化劑類免疫抑制劑，因此常被用于建立免疫低下動物模型[9–10]。本研究利用環磷酰胺誘導免疫低下小鼠模型，確定糖基化酪蛋白消化物對免疫低下小鼠免疫狀況的改善作用，并與酪蛋白消化物對比，以揭示酪蛋白美拉德糖基化反應對其消化物免疫活性的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性BALB/c小鼠（6～8 周齡；生產許可證號：SCXK（京）2012-0001，使用許可證號SYXK（黑）2016-007）和飼料 北京維通利華實驗動物技術有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1細胞 中國科學院細胞庫。動物實驗按照哈爾濱醫科大學實驗動物準則執行。

酪蛋白、乳糖、環磷酰胺和刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA） 美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（120 000 U/g） 北京奧博星生物技術有限公司；臺盼藍 美國Amresco公司；RPMI-1640培養基 美國HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）加拿大Wisent公司；半乳糖測試盒 美國BioAssay Systems公司；CCK-8檢測試劑盒 日本Dojindo公司；鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgM、IgA、IgG）檢測試劑盒 南京建成生物技術有限公司；其他化學試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

DELTA 320型精密pH計、AL204型電子分析天平梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；HF-90型CO2培養箱 美國力康公司；Model 680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物的制備

取一定量乳糖均勻分散于60 g/L酪蛋白溶液中，使乳糖和酪蛋白質量比為1.6∶1，調整酪蛋白終質量濃度為50 g/L、溶液pH 6.8。將反應物于沸水浴（100 ℃）中反應3 h，然后將樣品在冰浴中迅速冷卻至室溫。調整溶液pH值至4.5，4 000×g離心10 min，收集沉淀，pH 4.5下水洗2 遍，所得沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液調節pH 7，冷凍干燥后粉碎得到糖基化酪蛋白（乳糖含量（13.2±0.4）g/kg pro）。

質量濃度為50 g/L、pH 7.0的酪蛋白溶液和糖基化酪蛋白溶液中分別加入胰蛋白酶（7 000 U/g pro），37 ℃水解4 h，沸水浴滅酶5 min，快速冷卻至20 ℃，再用0.5 mol/L NaOH溶液調整pH值至7.0，冷凍干燥粉碎后得到酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物（乳糖含量（10.6±0.3）g/kg pro）。

1.3.2 化學指標測定

蛋白含量：用凱氏定氮法測定樣品含氮量，轉換因子為6.38。

乳糖含量：按照文獻[11]方法測定乳糖含量。稱取一定量樣品于安瓿瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解4 h，冷卻至20 ℃，用0.1 mol/L NaOH溶液調整pH值至7.0，用半乳糖測試盒測定水解液半乳糖濃度，然后換算為樣品中的乳糖含量。

1.3.3 小鼠分組及模型建立

雌性BALB/c小鼠80 只，適應性飼養1 周后，分為8 組：正常組、模型組、6 個實驗組，每組10 只。正常組小鼠每天灌胃生理鹽水28 d；模型組小鼠灌胃80 mg/kg mb環磷酰胺3 d后，再灌胃生理鹽水25 d；實驗組小鼠先灌胃80 mg/kg mb環磷酰胺3 d，再分別給予100、200、400 mg/kg mb的酪蛋白消化物或糖基化酪蛋白消化物25 d。

1.3.4 血清生化指標和Ig質量濃度測定

小鼠最后1 次灌胃24 h后，稱體質量，眼球采血。血液樣品于2 000×g離心10 min，用Beckman DXC 800自動生化分析儀測定血清生化指標。按照相應試劑盒說明書操作測定血清IgM、IgA、IgG質量濃度。

1.3.5 脾臟指數和胸腺指數測定

小鼠眼球取血后，脫頸處死，剖取脾臟和胸腺，濾紙吸取表面殘留血液及多余水分，分別稱濕質量。脾臟指數和胸腺指數分別按式（1）、（2）計算。

1.3.6 脾淋巴細胞增殖實驗

無菌條件下將各組小鼠剖腹，取脾臟，剪成小塊，置于200 目不銹鋼網篩，篩網中央浸沒于盛有Hank’s液的平皿中。無菌注射器芯研磨脾臟組織，用Hank’s液吹洗掉網篩上的剩余組織，收集脾臟組織懸液于無菌離心管，199×g離心5 min，棄去上清液。用3 mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置3 min，199×g離心5 min，棄去上清液；RPMI-1640培養液重懸細胞制成單細胞懸液，通過臺盼藍實驗計算細胞數，活細胞數不少于95%，調整細胞濃度為2×105個/mL。

將脾細胞懸液接種于96 孔板（200 μL/孔），同時每孔加20 μL ConA（終質量濃度5 μg/mL），置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24～48 h。每孔加20 μL CCK-8，繼續培養4 h，利用酶標儀在450 nm波長處測定光密度。以不添加脾細胞添加RPMI-1640培養液作空白孔。脾淋巴細胞增殖指數按式（3）[12]計算。

1.3.7 NK細胞活力分析

將YAC-1細胞（靶細胞）用RPMI培養液（含10% FBS）調整細胞濃度為1×104個/mL。將脾細胞懸液（5×105個/mL）和YAC-1細胞懸液（1×104個/mL）各100 μL/孔接種于96 孔板，同時設定效應細胞和靶細胞孔。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24～48 h后，每孔加15 μL CCK-8，繼續培養4 h，用酶標儀于450 nm波長處測定各孔光密度值。自然殺傷（natural killer，NK）細胞活力按式（4）[13]計算。

1.4 數據處理與分析

實驗結果均以平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0軟件進行Duncan’s多重比較，確定各組間數據的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 2 種酪蛋白消化物對小鼠血清生化指標的影響

表 1 酪蛋白消化物及糖基化酪蛋白消化物對小鼠血清生化指標的影響Table 1 Effect of glycated casein digest and casein digest on serum biochemical indices of mice

動物的血清生化指標常用于反映實驗動物的健康與生理狀況。已有研究表明，膳食咖啡酸通過影響血清生化指標，調控機體免疫功能[14]。飼料中添加β-伴大豆球蛋白可影響幼鯉生長以及其血清生化指標，實現幼鯉免疫狀態改善[15]。本研究中2 種酪蛋白消化物對小鼠17 項生化指標的影響如表1所示。與正常組小鼠相比，模型組小鼠各項指標水平均顯著降低（P＜0.05），表明環磷酰胺對小鼠產生不良影響。與模型組小鼠相比，糖基化酪蛋白消化物組小鼠各項指標水平均顯著增加（P＜0.05），表明糖基化酪蛋白消化物可改善小鼠生理狀況。然而，與酪蛋白消化物相比，糖基化酪蛋白消化物對小鼠生理狀況的改善程度要低一些。糖基化酪蛋白消化物的活性低于酪蛋白消化物，這可能與酪蛋白的糖基化反應有關。美拉德反應破壞了蛋白質中賴氨酸等必需氨基酸[16]，因此導致糖基化酪蛋白消化物在免疫低下小鼠中活性降低。

血清總蛋白（total protein，TP）主要由血清球蛋白（globulin，GLO）和血清白蛋白（albumin，ALB）構成。TP含量高，則動物營養狀況良好[17]。谷丙轉氨酶（alanine amiotransferase，ALT）是檢測肝功能的重要指標。血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）為蛋白質代謝后產物，是反映動物體內蛋白質代謝和氨基酸平衡狀況的指標[18]。對于5 項重要生化指標（TP、ALB、GLO質量濃度，ALT活力及BUN濃度），與模型組小鼠相比，酪蛋白消化物組小鼠5 項指標分別從45.8、26.7、18.9 g/L，36 U/L及2.4 mmol/L增加到59.4～67.1、34.1～37.7、24.1～31.6 g/L，40～61 U/L及3.0～3.3 mmol/L，而糖基化酪蛋白消化物處理組小鼠5 項指標分別增加到58.5～66.9、33.2～36.4、23.8～27.3 g/L，37～58 U/L及2.9～3.2 mmol/L。這些數據表明，酪蛋白消化物比糖基化酪蛋白消化物具有更好的免疫提升效率。

2.2 2 種酪蛋白消化物對血清中Ig分泌的影響

圖 1 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物對小鼠血清IgM（A）、IgA（B）和IgG（C）分泌的影響Fig. 1 Effects of glycated casein digest and casein digest on serum IgM (A), IgA (B), and IgG (C) levels of mice

Ig是機體主要的免疫分子，其含量高低直接反映動物機體免疫應答能力[19]。已有研究結果表明，大豆低聚糖可以增強小鼠IgM、IgA和IgG分泌[20]。酪蛋白肽通過促進Ig產生和免疫分子分泌，調控機體的免疫功能[21]。由圖1可知，與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清IgM、IgA和IgG質量濃度分別從806.4、724.7 μg/mL和13.9 mg/mL降低至726.9、654.1 μg/mL和11.3 mg/mL，表明環磷酰胺導致小鼠免疫低下。與模型組小鼠比較，酪蛋白消化物組小鼠血清IgM、IgA和IgG質量濃度分別增加至821.9～947.9、721.8～927.4 μg/mL和13.1～16.4 mg/mL，而糖基化酪蛋白消化物組小鼠血清IgM、IgA和IgG質量濃度分別增加至799.4～937.7、699.7～885.3 μg/mL和12.4～16.0 mg/mL。在同一劑量水平下，酪蛋白消化物顯示出比糖基化酪蛋白消化物更強的提升效果，證明糖基化反應降低了酪蛋白消化物提升Ig分泌的能力。Shi Jia等發現酪蛋白與乳糖的糖基化反應降低了酪蛋白消化物的免疫活性[5]；藺海鑫等發現原肌球蛋白與核糖的糖基化反應也降低了其免疫活性[22]；Shi Jia等研究結果表明，酪蛋白與乳糖的美拉德反應減弱了酪蛋白消化物對丙烯酰胺誘導小腸上皮細胞屏障損傷的保護作用[23]。

2.3 2 種酪蛋白消化物對小鼠免疫器官指數的影響

脾臟是動物的外周免疫器官，產生淋巴細胞，參與體液和細胞免疫。胸腺是動物的一級免疫器官，對T細胞成熟和分化起作用[24]。因此，脾臟指數、胸腺指數直接反映機體免疫狀況。研究表明，毛豆腐提取物可以增加脾臟指數和胸腺指數，提高動物免疫狀況[25]。來源于κ-酪蛋白的糖巨肽具有免疫抑制活性，雞蛋卵清蛋白源糖肽具有顯著的免疫調節功能[26-27]。甘薯糖蛋白可顯著提高小鼠脾臟指數和胸腺指數，脾淋巴小節增多增大，胸腺T細胞線粒體數量增多，表明甘薯糖蛋白具有明顯的增強免疫調節作用[28]。

圖 2 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物對小鼠脾臟指數（A）和胸腺指數（B）的影響Fig. 2 Effects of glycated casein digest and casein digest on spleen (A)and thymus (B) indices of mice

由圖2可知，與正常組小鼠比較，模型組小鼠的脾臟和胸腺指數均顯著降低（P＜0.05），表明環磷酰胺影響小鼠免疫器官的發育。與模型組小鼠比較，給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，小鼠胸腺指數和脾臟指數均顯著增加（P＜0.05），且呈劑量依賴效應。酪蛋白消化物導致小鼠的脾臟和胸腺指數分別增加至3.24～4.26 mg/g和1.32～1.58 mg/g，而糖基化酪蛋白消化物僅分別增加至3.06～3.89 mg/g和1.26～1.48 mg/g。同一劑量水平下，酪蛋白消化物對小鼠脾臟和胸腺指數的提升作用強于糖基化酪蛋白消化物，證明糖基化反應不利于酪蛋白消化物改善小鼠脾臟和胸腺的生長發育狀況。

2.4 糖基化酪蛋白消化物對脾淋巴細胞增殖和NK細胞活力的影響

脾淋巴細胞是體內免疫細胞之一，其增殖和分化是機體免疫應答過程的一個重要階段。因此，淋巴細胞增殖水平評估是研究細胞免疫的常用方法[29]。NK細胞是重要的免疫效應細胞，在體內抗腫瘤非特異性免疫中發揮重要作用[30]。已有研究結果表明，乳蛋白肽可以促進小鼠脾淋巴細胞增殖、提高NK細胞活力[21,31]。胃蛋白酶水解鯉魚卵蛋白后，其水解物顯著提高了脾淋巴細胞增殖作用和NK細胞活力[32]。大豆糖肽對ConA誘導的脾細胞有增殖抑制作用，而對正常生長的脾細胞有增殖促進作用[33]。由圖3可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的脾淋巴細胞增殖指數和NK細胞活力均顯著下降（P＜0.05），而2 種消化物以劑量依賴方式促進小鼠脾淋巴細胞增殖和增強NK細胞活力。與模型組小鼠相比，酪蛋白消化物處理24 h和48 h后，小鼠脾淋巴細胞增殖指數分別從0.951和0.974增加至1.154～1.342和1.184～1.472，NK細胞活力分別從30.8%和32.2%增加至35.8%～48.8%和46.1%～61.4%；糖基化酪蛋白消化物處理24 h和48 h后，小鼠脾淋巴細胞增殖指數分別增加至1.147～1.316和1.176～1.379，NK細胞活力分別增加至33.1%～45.7%和41.5%～58.3%。整體上看，糖基化酪蛋白消化物刺激小鼠脾細胞的能力仍然低于酪蛋白消化物，再次證明糖基化反應降低了酪蛋白消化物提升小鼠免疫細胞活性的作用。

圖 3 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物對小鼠淋巴細胞增殖指數和NK細胞活力的影響Fig. 3 Effects of glycated casein digest and casein digest on lymphocyte proliferation index and NK cell activity of mice

3 結 論

采用環磷酰胺處理后，小鼠免疫功能顯著下降，與正常組小鼠相比，模型組小鼠17 項血清生化指標水平顯著降低，同時3 種血清Ig質量濃度、脾臟、胸腺、脾淋巴細胞增殖指數、NK細胞活力等其他重要免疫指標也顯著降低。實驗結果表明，免疫低下模型小鼠給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，小鼠免疫狀況均得到改善，各項免疫指標水平增加，提示兩種消化物均具有提升免疫作用。本研究結果進一步表明，酪蛋白消化物具有比糖基化酪蛋白消化物更好的免疫提升效率，酪蛋白經美拉德糖基化反應導致其消化物的免疫活性降低，從而揭示蛋白質美拉德糖基化反應的潛在不利作用。考慮到蛋白質的美拉德糖基化反應導致蛋白質氨基酸被破壞和免疫活性降低，因此，控制乳制品加工處理過程中的美拉德反應具有必要性。