魔芋甘露寡糖抗肥胖活性及機制

溫永平，朱 迪，孫 健，閆巧娟，江正強,

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京 101107；3.中國農業大學工學院，北京 100083）

肥胖是一種常見慢性代謝疾病，受到環境、飲食不均衡以及遺傳等多種因素影響，這些因素導致能量攝入和吸收利用的不平衡[1]。體質量增加、高脂血癥、高血糖癥和慢性炎癥等，已成為肥胖患者核心表現[2]。肥胖不但影響生活品質，也會誘發多種慢性疾病，包括癌癥、心腦血管病、內分泌失調和二型糖尿病[3]，每年直接或者間接導致全世界數千萬人死亡。目前，全球約13%成年人屬于肥胖人群[4]。因此，防治和緩解肥胖及其并發癥是亟待解決的公共健康問題。目前，藥物是治療肥胖的常用且有效手段。功能性寡糖是由2～10 個單糖通過糖苷鍵連接的低度聚合糖，來源廣泛，不易被消化道吸收，具有多種生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗高血壓、抗炎、抗癌、免疫刺激劑和促進礦物質吸收等[5]，可開發為抗肥胖膳食補充劑。研究表明，甘露寡糖可以通過調節腸道微生物，改善宿主代謝，減少肝脂肪變性，改善葡萄糖耐受性，防治飲食誘導的肥胖[6]。

魔芋甘露寡糖（konjac mannooligosaccharides，KMOS）是由β-D-甘露糖和β-D-葡萄糖殘基組成的一種可溶性功能性寡糖，通過魔芋葡甘露聚糖水解獲得[7]。目前研究認為，魔芋甘露寡糖具有緩解2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的結腸炎作用[8]、增加老年BALB/c小鼠的免疫活性[9]、通過調節腸道菌群增效二甲雙胍的降血糖作用以及緩解高脂膳食誘發的體質量增加的作用[7,10]、通過調節糖原代謝通路和胰島素分泌等緩解高糖水平誘發的大鼠代謝綜合征[11]，通過調節腸道菌群干預機體脂代謝過程的作用[12]等。但關于魔芋甘露寡糖抗肥胖及其誘發的氧化應激反應的作用及機理尚鮮見報道。

本研究以高脂膳食誘導的C57BL/6J小鼠為實驗動物模型，通過膳食干預作用，探究魔芋甘露寡糖對小鼠體質量及脂代謝的調控作用及分子機制，以期為功能性寡糖可能的抗肥胖機制的深入研究以及為開發具有抗肥胖特性的膳食補充劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

2 月齡SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物質量合格證明編號：No. 11002900036533，生產許可證號：SCXK（京）2014-0010。飼料購自北京科奧協力飼料有限公司，包括標準飼料（D12450B）和高脂飼料（D12492，60%熱量來自脂肪）。

魔芋甘露寡糖（平均分子質量約342.3～1 639.44 Da，甘露糖與葡萄糖的物質的量比1.45∶1，聚合度2～10）西安源森生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）及載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的酶聯免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海鑫樂生物科技有限公司；mRNA提取試劑盒、mRNA反轉錄試劑盒 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

CFX系列實時熒光定量（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；BS-420自動分析儀 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；BX60光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養、模型構建、實驗分組及樣品采集

選取10 周齡的雄性C57BL/6J小鼠在標準條件（12 h/12 h光暗循環、相對濕度（55±5）%、溫度（25±2）℃）下飼養。1 周適應性喂養后，將小鼠隨機分成7 組，每組12 只：對照組（Control組，飼喂標準飼料），魔芋甘露寡糖對照組（KMOS-H組，飼喂標準飼料+1 200 mg/（kg mb·d）魔芋甘露寡糖），模型組（HFD組，飼喂60%高脂飼料），魔芋甘露寡糖高、中、低劑量處理組（HFD+KMOS-H、HFD+KMOS-M、HFD+KMOS-L組，分別飼喂高脂飼料+400、800、1 200 mg/（kg mb·d）魔芋甘露寡糖），二甲雙胍處理組（HFD+Met組，飼喂高脂飼料+400 mg/（kg mb·d）二甲雙胍）。高脂膳食小鼠體質量比對照組高20%，即認定為肥胖小鼠[13]。同時給予高熱量高脂食物與受試樣品，考察待測樣品預防肥胖和降脂的效果。實驗周期為12 周，實驗期間動物自由攝食和自由飲水。動物方案經中國農業大學機構動物倫理委員會原則批準。

小鼠禁食16 h后，在頸脫位之前，通過從C57BL/6J小鼠摘出眼球來收集血液樣品，3 500 r/min和4 ℃下離心15 min后，分離血清，并進行分裝，保存于-80 ℃冰箱中。快速分離肝臟和脂肪等組織，用生理鹽水清洗組織，除去組織殘留的血液。用濾紙吸干后，稱質量。部分樣品固定于體積分數10%福爾馬林溶液中，保存在4 ℃冰箱，用于形態觀察；部分樣品凍存于-80 ℃冰箱，用于后續指標分析。

1.3.2 小鼠體質量、飲水量及攝食量檢測

實驗期間，每周進行體質量、飲水量和攝食量的監測，按照下式進行能量攝入計算。

攝入能量/kJ＝食物攝入量/g×飼料能量/（kJ/g）

1.3.3 血清生化指標檢測

取小鼠血清，按照試劑盒檢測操作要求，檢測血清中TC、LDL-C、HDL-C、NEFA的濃度，以及SOD、CAT、POD的活力和ROS、GSH的表達水平。按照ELISA試劑盒的操作要求進行血液中TNF-α、IL-6和MCP-1水平檢測。

1.3.4 肝臟組織生化分析

肝臟組織于液氮中研磨并稱取一定質量，于生理鹽水中進行勻漿。用試劑盒檢測APOE和NEFA的表達水平。

1.3.5 脂肪組織HE染色

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法，取已固定的皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪和肩胛脂肪進行脫水、石蠟包埋、常規切片、HE染色等操作。以200 倍放大率，在光學顯微鏡下觀察組織形態并拍照，進行病理學分析。

1.3.6 肝臟組織免疫組化分析

取肝臟組織進行脫水、石蠟包埋、常規切片、過氧化氫消融、室溫封閉、脂肪酸轉運酶/白細胞分化抗原36（cluster of differentiation，CD36）抗體孵育、對應的二抗孵育、3,3-二氨基聯苯胺著色和脫水干燥等操作。以200 倍放大率，在光學顯微鏡觀察CD36表達量并拍照分析。

1.3.7 逆轉錄qPCR檢測

使用mRNA提取試劑盒，從脂肪組織和肝臟組織中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix RR036A試劑盒對1 μg總RNA進行反轉錄反應。使用POWER SYBR Green master mix試劑盒，以cDNA作為模板，分析mRNA表達水平。qPCR程序如下：初始保持步驟，在95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個循環；72 ℃ 30 s。55～95 ℃逐步獲得熔解曲線。在通過基因GAPDH標準化后，使用（2-ΔΔCt）比較方法，分析靶基因的表達量。靶基因的引物見表1。

表 1 qPCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time polymerase chain reaction

1.4 數據統計分析

所有數據表示為3 次或更多次獨立實驗的平均值±標準誤差。數據的差異顯著性通過單因素方差分析進行比較，采用SPSS 19.0軟件中的Tukey多范圍檢驗。

2 結果與分析

2.1 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導的小鼠體質量和器官質量的影響

表 2 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導小鼠的體質量和器官質量的影響Table 2 Effect of KMOS on body mass and organ mass of HFD-induced mice

由表2可知，相比對照組，HFD組小鼠最終體質量增加21.15%（P＜0.01）。魔芋甘露寡糖處理組小鼠最終體質量和體質量增加量均極顯著低于HFD組（P＜0.01），分別減少了9.76%和36.36%。由此可見，魔芋甘露寡糖有顯著下調小鼠體質量的作用。相比對照組，HFD組肝臟、腎臟、腎周脂肪、肩胛脂肪、附睪脂肪和皮下脂肪組織的質量極顯著增加（P＜0.01）。與HFD組相比，魔芋甘露寡糖處理組和二甲雙胍處理組肝臟、腎臟及脂肪組織的質量均極顯著降低（P＜0.01）。魔芋甘露寡糖高劑量處理后，肝臟、腎臟、腎周脂肪、肩胛脂肪、附睪脂肪和皮下脂肪的質量分別減少28.96%、22.96%、61.56%、63.63%、46.81%和54.24%，說明魔芋甘露寡糖能夠顯著改善肝臟和腎臟組織脂肪聚積，緩解脂肪組織堆積，從而抑制高脂膳食誘導的小鼠體質量增加趨勢。此外，魔芋甘露寡糖對正常小鼠各組織器官質量均無顯著性的影響（P＞0.05）。

2.2 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導的小鼠血脂指標的影響

表 3 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導小鼠血脂水平的影響Table 3 Effect of KMOS on blood lipid levels of HFD-induced mice

由表3可知，與對照組相比，高脂膳食極顯著增加小鼠血清中TC、LDL-C和NEFA水平（P＜0.01），并下調HDL-C水平。相比HFD組，魔芋甘露寡糖處理組極顯著改善小鼠血脂異常情況（P＜0.01），且呈劑量依賴性。其中，高濃度魔芋甘露寡糖極顯著降低小鼠TC、LDL-C和NEFA水平（P＜0.01），抑制率分別為23.14%、35.93%和31.18%，HDL-C水平提高約1.0 倍。表明魔芋甘露寡糖具有顯著調節小鼠血脂代謝的作用。

2.3 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導的小鼠血液氧化應激指標的影響

如圖1A～C所示，高脂膳食極顯著增加血清中炎癥因子水平（P＜0.01），包括TNF-α、IL-6和MCP-1。魔芋甘露寡糖呈現劑量依賴性地降低高脂膳食誘導的小鼠炎癥因子濃度，高劑量的魔芋甘露寡糖對炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1水平分別降低21.72%、60.97%和66.69%。表明魔芋甘露寡糖能極顯著下調高脂膳食誘導小鼠炎癥反應。進一步研究發現，高脂膳食極顯著增加血清中的ROS水平（圖1D）（P＜0.01），魔芋甘露寡糖高、中、低劑量處理組對ROS水平的抑制率分別為67.78%、31.61%和33.82%。此外，圖1E所示魔芋甘露寡糖極顯著緩解由高脂膳食誘發的抗氧化物酶（SOD、GSH、CAT和POD）活力降低（P＜0.01）。相比HFD組，魔芋甘露寡糖高劑量處理組的SOD、GSH、CAT和POD的活力極顯著增加了6.09%、45.28%、61.73%和12.58%。以上結果表明，魔芋甘露寡糖通過激活抗氧化物酶活性緩解高脂膳食誘導小鼠的炎癥反應。

圖 1 魔芋甘露寡糖對高脂膳食小鼠血清炎癥因子水平和抗氧化物酶活性的調節作用Fig. 1 Effect of KMOS on inflammatory factor levels and antioxidant enzyme activities in serum of HFD-fed mice

2.4 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導的小鼠脂肪組織的影響

如圖2A、B所示，高脂膳食顯著增加腎周脂肪、肩胛脂肪、附睪脂肪和皮下脂肪組織的細胞面積（P＜0.05）。不同濃度的魔芋甘露寡糖顯著減小脂肪組織細胞面積，并且在相同視野中，脂肪細胞數目極顯著增加（P＜0.01）。魔芋甘露寡糖高劑量處理組極顯著下調4 種脂肪組織的平均面積（P＜0.01），對于腎周脂肪、肩胛脂肪、附睪脂肪和皮下脂肪組織的細胞面積分別下調56.41%、77.71%、75.77%和81.38%。如圖2C所示，HFD組脂肪生成關鍵基因極顯著升高（P＜0.01），包括氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors，Pparγ）、膽固醇調節元件結合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，Srebp1c）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase 1，Acaca）和脂肪酸合酶（fatty acid synthase，Fasn）基因。而高濃度的魔芋甘露寡糖則極顯著下調Pparγ、Srebp1c、Acaca和Fasn的表達（P＜0.01），分別下調28.29%、51.48%、29.40%和46.72%。結果表明，魔芋甘露寡糖正向調節脂肪組織脂質代謝過程。

圖 2 魔芋甘露寡糖對高脂膳食小鼠脂肪組織分布和脂代謝相關基因表達的調節作用Fig. 2 Regulation of KMOS on adipose tissue distribution and lipid metabolism-related gene expressions in HFD-fed mice

2.5 魔芋甘露寡糖對高脂膳食誘導的小鼠肝臟組織的影響

圖 3 魔芋甘露寡糖對高脂膳食小鼠肝臟脂肪積聚和脂代謝相關基因表達的調控作用Fig. 3 Regulation of KMOS on liver fat accumulation and lipid metabolism-related gene expression in HFD-fed mice

如圖3A所示，高脂膳食顯著增加肝臟中CD36的表達，而魔芋甘露寡糖抑制CD36的表達，表明魔芋甘露寡糖能緩解由高脂膳食誘導的肝臟脂質聚積。如圖3B所示，魔芋甘露寡糖極顯著抑制由高脂膳食誘發的NEFA水平升高和APOE水平下調（P＜0.05），高濃度魔芋甘露寡糖下調NEFA水平（約61.76%），并上調APOE的mRNA表達（約95.17%）。結果表明，魔芋甘露寡糖對肝臟組織NEFA和APOE具有一定調控作用。進一步探究脂質代謝相關基因表達情況。如圖3C所示，對于高脂膳食小鼠，魔芋甘露寡糖顯著促進膽固醇代謝關鍵基因肝受體（liver X receptors，LXR）的mRNA表達（P＜0.05）（約提升86.82%）；顯著抑制膽固醇合成限速酶基因羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase，Hmgcr）表達（P＜0.05）（約減少60.45%）。如圖3D所示，高脂膳食處理組脂肪生成相關基因表達水平顯著上調（P＜0.05）。魔芋甘露寡糖濃度依賴性抑制Pparγ、Srebp1c、Acaca和Fasn的mRNA表達，抑制率分別為56.69%、41.45%、47.85%和32.01%。因此，魔芋甘露寡糖正向調控肝臟組織膽固醇代謝和脂質代謝過程。

3 討 論

眾所周知，肥胖是由于能量代謝不平衡，導致機體內脂肪過度累積，表現為脂肪細胞數量增加或體積增大[1]。肥胖與多種代謝性疾病關系緊密[14]。功能性寡糖由于具有多種有效的生物活性和無副作用的特點，成為開發抗肥胖的膳食補充劑的重要配料[15]。多種寡糖已經被證明有抗肥胖的作用，如殼寡糖和新瓊寡糖[16-17]。研究結果表明，魔芋甘露寡糖降低高脂組小鼠血清甘油三酯和膽固醇，升高密度脂蛋白，說明魔芋葡甘露寡糖有明顯的降脂作用[18]。同樣的，魔芋甘露寡糖可以顯著減慢體質量增加，降低血清脂質水平，緩解胰島素抵抗，并改善腸道菌群的組成，從而發揮抗肥胖的功能活性[10]。由此，甘露寡糖對于脂肪代謝發揮積極的干預，而具有減肥的潛力[6,19]，但其作用機制并不明確。本研究證實魔芋甘露寡糖具有顯著的減肥功效，且通過調節脂肪組織和肝臟組織的脂代謝過程以及干預炎癥反應發揮其抗肥胖的功能活性。

本實驗所選用的高脂膳食誘導的HFD組小鼠，在體質量、體脂含量以及血脂水平均顯著高于正常組小鼠。膳食補充魔芋甘露寡糖顯著降低肥胖小鼠的體質量、脂肪聚積和單個脂肪體積，下調TC、NEFA和LDL等的水平，該作用效果與陽性對照組相似。研究認為，功能性寡糖主要通過改變腸道微生物組成，影響能量代謝，改善脂代謝過程[20]。除此之外，慢性炎癥也是心血管疾病、慢性腎病、糖尿病和癌癥等疾病的一個關鍵風險因素，其潛在的機制包括氧化應激引發的功能失調、中心性肥胖、腸道通透性增加、微生物群組成變化和細胞衰老等[2]。過量的脂肪堆積后，ROS介導的細胞因子（IL-6、TNF-α和MCP-1）分泌異常，外周組織和中樞神經系統受到影響，導致炎癥反應和氧化應激增強[21]。反之，與肥胖相關的全身性慢性炎癥又直接影響機體的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗[22]。由此可知，氧化應激成為誘發肥胖相關并發癥的主要分子機制之一[23]。如同殼聚糖，魔芋甘露寡糖也可以通過其對慢性炎癥的干預作用，來解釋魔芋甘露寡糖多種代謝活性[24]。本研究顯示，魔芋甘露寡糖抑制炎癥因子，如TNF-α、IL-6和MCP-1的表達，下調血清中活性氧濃度，增加SOD和CAT等抗氧化物酶活力。因此，魔芋甘露寡糖干預具有抗肥胖、降血脂、慢性炎癥和預防肝脂肪變性等多種功能活性，并且可能通過抑制高脂膳食誘發的氧化應激水平改善脂代謝紊亂，但兩者之間的關系及具體的作用機制仍有待于進一步研究。

為了進一步研究魔芋甘露寡糖抑制高脂膳食引起的脂肪聚積和肝臟脂滴過度積累的潛在機制，本實驗探討了其調節肝臟組織和脂肪組織的脂肪合成相關基因表達的作用。PPARγ是核受體超轉錄因子家族的重要成員，是調控脂肪細胞分化的關鍵因子[16,25]。有研究認為，PPARγ可以通過調節炎癥反應和與脂質合成和脂肪酸β-氧化的各種相關代謝酶，改善脂質代謝和胰島素敏感性，是調控肥胖、胰島素抵抗和心血管疾病的核心[26-27]。研究表明，殼寡糖（GO2KA1）通過腸α-葡糖苷酶和脂肪組織PPARγ的表達介導抗糖尿病的功能活性[28]。相似地，本研究證明了魔芋甘露寡糖通過調節脂肪合成相關基因表達，如Pparγ、Srebp1c、Acaca和Fasn，對脂代謝調控發揮了關鍵的作用。此外，CD36可以直接介導肝臟組織長鏈脂肪酸攝取和轉運，也是LDL、糖化蛋白和游離脂肪酸等炎性代謝產物的識別蛋白，并促進脂肪酸的攝取和氧化作用，CD36被認為是機體代謝和炎癥反應鏈接的橋梁[29]。本研究表明，魔芋甘露寡糖顯著的緩解由高脂膳食誘發的肝臟組織中CD36的表達增加。在肝臟組織中，魔芋甘露寡糖還通過顯著的促進膽固醇代謝關鍵基因LXR的表達，并抑制Hmgcr的表達，調控膽固醇代謝過程。其中，LXR是一個核受體，調節肝臟膽固醇和脂肪酸代謝。研究認為LXR激活可抑制高脂血癥誘導的肝臟脂肪聚積[30]。作為LXR的下游基因，Hmgcr基因調控HMG-CoA還原酶的表達[31]。HMG-CoA還原酶是膽固醇合成中的關鍵酶，參與低密度脂蛋白的代謝過程，并受到膽固醇和他汀類藥物的抑制[32]。綜上，魔芋甘露寡糖通過調節脂肪合成和膽固醇代謝關鍵基因，影響肝臟脂質聚集。

4 結 論

魔芋甘露寡糖能夠抑制高脂膳食小鼠體質量增加，降低血脂水平，調整體脂分布；調控脂代謝關鍵基因表達，改善肝脂肪變性；調節氧化應激水平，抑制炎癥反應。魔芋甘露寡糖可以作為膳食補充劑的配料，發揮抗肥胖、緩解肝脂肪變性以及改善高脂膳食誘發氧化應激的功能活性。