麥麩中烷基間苯二酚誘導HepG2細胞自噬和凋亡

郭亞洲，楊小明,，李月英

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013）

小麥是我國北方居民主食，隨著生活水平的提高，在食不厭精的傳統下，小麥的加工越來越精細，其剝落的皮層混合少量未剝凈的胚乳和胚芽形成了麥麩。流行病學調查發現，食用含有麥麩的全谷物制品可以降低肥胖、糖尿病和一些癌癥的發病率，特別是降低結腸癌、乳腺癌和前列腺癌的發病率[1-3]。麥麩脂溶性成分比水溶性成分能更有效抑制人結腸癌細胞生長[4]。進一步的研究表明，小麥麩皮中的烷基間苯二酚（alkylresorcinols，ARs）具有抗腫瘤活性[1]。ARs為1,3-二羥基苯衍生物，在苯環第5位碳上連接一個含奇數碳的烷基側鏈，主要由C15:0、C17:0、C19:0、C21:0、C23:0和C25:0組成[5-6]，小麥麥麩中以C19:0和C21:0含量最高[7-8]。ARs結構見圖1。

圖 1 ARs結構式Fig. 1 Structures of alkylresorcinols

由ARs結構式可知，其為兩性分子，易溶于非極性溶劑而難溶于水，其在水中的溶解能力與烷基鏈長相關，烷基鏈越長，非極性程度越強，在水中溶解性越差[9]。ARs烷基側鏈長度的增加還使其對結腸癌細胞的抑制作用降低[10]。ARs在體內的作用與其吸收、代謝密切相關，小腸能部分吸收或代謝ARs，血漿中也檢測到一定濃度的ARs存在[11-13]。人群樣本調查發現，人血漿中ARs含量與全麥或黑麥的攝入量呈正相關，與遠端結腸癌風險呈負相關[11-14]。對ARs的抗腫瘤機理研究發現，ARs能夠破壞腫瘤細胞的DNA并防止其修復[15]，加速遺傳毒性損傷細胞的死亡率[16]，抑制癌細胞形成。

天然化合物通過誘導腫瘤細胞自噬和凋亡可以達到控制癌癥細胞生長增殖的作用[17-19]。近年來有關ARs的抗腫瘤研究越來越多[1,10]，但對ARs誘導腫瘤細胞自噬和凋亡的具體研究報道較少。本研究采用制備色譜法從麥麩中分離純化得到ARs中含量最高的兩個同系物（C19:0和C21:0），以液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）對2 個ARs同系物進行結構驗證，并探討ARs對人肝癌（HepG2）細胞自噬和凋亡的作用，為開發麥麩作為輔助抗腫瘤功能性食品原料提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩 鎮江富華面粉有限公司；HepG2細胞中國科學院細胞生物學研究所（上海）。

Fast Blue RR 1/2 ZnCl2上海羅恩試劑公司；甲醇（色譜級） 美國TEDIA公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 美國Gibco公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；山羊抗小鼠多克隆免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（稀釋比1∶10 000）、山羊抗兔多克隆IgG（稀釋比1∶10 000）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒上海碧云天生物技術公司；β-actin抗體（稀釋比1∶1 000） 圣克魯斯生物技術（上海）有限公司；剪切型Caspase3抗體 沈陽萬類生物科技有限公司；其余抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；其他試劑（均為分析純）均購自國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

HSGF254硅膠板（20 cm×20 cm，0.4～0.5 mm）國藥集團化學試劑（上海）有限公司；制備高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備WK 500LC-500P泵、SPD-500紫外檢測器、Marathon XT手動進樣器） 杭州旭昱科技股份有限公司；LC-MS儀（配備Xcalibur 2.0.7 SPI軟件、LXQ離子阱） 美國Thermo公司；iMark-17852酶標儀美國Bio-Rad公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司；MiniChemi化學發光成像儀 北京賽奇創想科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ARs的制備和鑒定

ARs的制備：干燥的麥麩經16 目篩過濾除去粉末，取1 kg麥麩于2 L乙酸乙酯中浸泡48 h，真空抽濾，濾渣重復浸提2 次，合并提取液，旋蒸得到浸膏。浸膏以少量乙酸乙酯溶解，點樣于HSGF254制備薄層硅膠板，用石油醚-乙酸乙酯（7∶3，V/V）展開。根據間苯二酚與重氮鹽特異性顯色反應確定Rf[20]，采集斑點，洗脫，濃縮。將初次分離物采用柱層析（2 cm×35 cm，200～300 目硅膠）二次純化，用氯仿-乙醚（9∶1，V/V）以2 mL/min流速洗脫，10 mL/管，用紫外光譜掃描和重氮鹽反應檢測各管中的ARs。依據ARs紫外特征吸收峰[20-21]結合ARs與重氮鹽顯色反應呈紫紅色，選取餾分，合并濃縮。濃縮的餾分繼續采用制備HPLC儀分離，收集AR C19:0和C21:0餾分。HPLC條件：Welch Ultimate AQ-C18色譜柱（250 mm×21.2 mm，10 μm）；流動相甲醇；流速12 mL/min；紫外檢測波長280 nm。

ARs的鑒定：用LC-MS對純化后組分進行成分鑒定。檢測條件：流動相為甲醇；流速1.0 mL/min；紫外檢測波長280 nm；進樣量20 μL；電噴霧電離源；負離子模式；掃描范圍m/z 50～1 000；噴霧電壓4.5 kV；鞘氣流量35 arb；輔助氣體流量5 arb；離子傳輸管溫度180 ?C；噴霧壓力1.4 MPa；毛細管溫度275 ?C；毛細管電壓30 V；透射電子顯微鏡電壓100 V。

1.3.2 細胞存活率測定

采用MTT法測定ARs的細胞毒性。HepG2細胞用含10% FBS的DMEM培養液在37 ?C、5% CO2細胞培養箱中培養。取對數生長期細胞，以5×103個/孔接種于96 孔板，待細胞貼壁后用不同終質量濃度（10、20、40、80、160、320 μg/mL）的ARs（用DMSO溶解，且細胞培養液中DMSO體積分數不超過0.1%）處理細胞，對照組每孔加入100 μL含有體積分數0.1% DMSO的培養液，無細胞孔加入培養液作為空白組，每組5 個復孔。培養24、48 h后，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT處理4 h，吸去培養液，加入100 μL/孔DMSO溶解生成的甲瓚晶體，用酶標儀在490 nm處測定各孔光密度值。細胞存活率按下式計算。

用SPSS 22.0軟件計算ARs的半抑制質量濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡

以5×105個/孔將HepG2細胞接種在6 孔板，經終質量濃度80、160 μg/mL ARs處理24 h后，根據Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟進行操作收取細胞，用流式細胞儀采集2萬 個細胞樣本并分析各組細胞凋亡率。

1.3.4 蛋白質免疫印跡法檢測蛋白表達

以5×105個/孔將HepG2細胞接種在6 孔板。經不同終質量濃度ARs處理24 h后，根據王海等[18]的方法提取細胞總蛋白并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，化學發光成像儀進行曝光。使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度。

1.4 數據統計與分析

結果表示為平均值±標準差，實驗重復至少3 次。使用SPSS 20.0統計軟件進行數據統計分析和Student t檢驗，P＜0.05表示有統計學顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 ARs制備結果

麥麩乙酸乙酯提取物首先采用HSGF254硅膠板粗分離，分別收集各斑點，采用重氮鹽特異性顯色，顯色反應呈紅色的斑點（Rf＝0.52）含有間苯二酚結構，收集Rf＝0.52的斑點組分，進行硅膠柱色譜分離。根據硅膠柱色譜各餾分的紫外掃描圖，組分5和組分6在275 nm和280 nm波長處具有ARs特征吸收峰（圖2），且與重氮鹽顯色反應陽性。

圖 2 柱層析收集組分4～7的紫外掃描光譜Fig. 2 UV absorption spectra of fractions 4 through 7 eluted from column chromatography

將符合上述條件的組分（組分5、6）進行合并濃縮，用制備HPLC進一步純化。根據制備HPLC圖，收集2 種含量較高的組分。將保留時間為10.715 min的組分記為A1；保留時間13.607 min的組分記為A2（圖3）。

圖 3 組分5、6的制備HPLC圖Fig. 3 Preparative high performance liquid chromatography of fractions 5 and 6

2.2 LC-MS鑒定ARs結構的結果

圖 4 組分A1、A2的LC-MS分析圖譜Fig. 4 LC-MS chromatograms of fractions A1 and A2

LC-MS分析的總離子流圖和質譜圖如圖4所示。組分A1、A2的一級質譜分別顯示了m/z 376和m/z 404分子離子。根據一級和二級質譜圖，2 個主峰的碎片損失均為m/z 42，考慮到分析物的結構，這種損失對應于乙烯酮（C2H2O），這與Ross等[22]對ARs的研究結果一致。上述結果證實分離物成分是ARs C19:0和C21:0。根據總離子流圖，用面積歸一化法得到兩種組分的總相對含量為81%。這些ARs C19:0和C21:0同系物在后續實驗中簡稱為ARs。

2.3 ARs處理對HepG2細胞存活率的影響

圖 5 ARs處理對HepG2細胞存活率的影響Fig. 5 Effects of AR treatments on the survival rate of HepG2 cells

由圖5可知，40、80、160 μg/mL和320 μg/mL ARs處理HepG2細胞24 h和48 h后，細胞存活率高度顯著降低（P＜0.001），呈劑量和時間依賴效應關系，處理48 h時對細胞毒性更加明顯。結果顯示ARs對體外培養HepG2細胞活力具有較好的抑制效果，計算得到其IC50為112.6 μg/mL。

2.4 ARs處理對HepG2細胞凋亡的影響

圖 6 ARs處理對HepG2細胞凋亡的影響Fig. 6 HepG2 cell apoptosis detected by flow cytometry

采用80、160 μg/mL的ARs處理HepG2細胞24 h，經Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果如圖6A～C所示。由圖6D可知，160 μg/mL ARs誘導后細胞凋亡率相比對照組極顯著升高（P＜0.01）。

2.5 ARs處理對HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的影響

圖 7 蛋白免疫印跡法檢測HepG2細胞凋亡相關蛋白Fig. 7 Expression of apoptosis-associated proteins detected by Western blot

分別用10、20、40、80 μg/mL和160 μg/mL ARs處理HepG2細胞24 h，細胞凋亡相關蛋白免疫印跡圖如圖7A所示。由圖7可知，較高質量濃度（80、160 μg/mL）ARs處理24 h，促凋亡蛋白Bax相對表達水平高度顯著增加，且抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，凋亡啟動蛋白剪切型Caspase3相對表達水平高度顯著增加（P＜0.001）。

2.6 ARs處理對HepG2細胞自噬相關蛋白表達的影響

圖 8 蛋白免疫印跡法檢測HepG2細胞自噬相關蛋白表達量Fig. 8 Expression of autophagy-associated proteins detected by Western blot

用0、40、80、160 μg/mL ARs處理HepG2細胞24 h，其自噬相關蛋白表達結果如圖8A所示。由圖8B～D可知，160 μg/mL ARs處理細胞24 h后，自噬上游蛋白Beclin-1相對表達量極顯著升高（P＜0.01），LC3II蛋白表達水平極顯著增加（P＜0.01），自噬下游蛋白p62表達極顯著下降（P＜0.01），細胞自噬水平增加。以上結果表明，ARs可能通過調節自噬相關蛋白表達誘導自噬體形成和自噬溶酶體溶解，從而誘導HepG2細胞自噬。

3 討 論

全谷物食品對心血管疾病和某些癌癥的預防作用已經被流行病學研究所證實[13]。麥麩中ARs的抗腫瘤作用越來越引起廣泛的關注[1,23]。對麥麩中活性化合物的研究，及全麥食品的營養及麥麩的開發利用都有一定的價值。

前期已有研究報道ARs具有體外抑制前列腺癌和結腸癌細胞生長的效果，但大多數研究限于細胞存活率的測定[1-3]，未有更進一步的研究。本研究也發現經ARs處理后HepG2細胞存活率顯著降低，說明ARs對體外培養的HepG2細胞具有較好的生長抑制效果，經ARs處理后細胞凋亡率顯著增加，證明ARs可以通過誘導肝癌細胞凋亡發揮抗腫瘤效果。Bcl-2是典型的凋亡抑制因子，Bax是典型的凋亡促進因子，Bcl-2和Bax的表達情況常被用作評價癌變程度[17]。本實驗結果顯示ARs通過顯著下調Bcl-2表達和上調Bax表達來促進肝癌細胞凋亡。Caspases家族作為哺乳動物細胞中程序性死亡的介導者和執行者參與癌細胞的凋亡，大多細胞凋亡需要通過Caspase3介導的信號傳遞途徑誘導癌細胞凋亡[17]。ARs通過增加肝癌細胞中的Caspase3表達促進癌細胞凋亡，起到體外抗癌效果。自噬的失調與腫瘤的發生、發展和轉移之間存在密切關系，過度的自噬也會導致細胞死亡。自噬體中LC3I的存在和LC3II的轉化被用作自噬的指標[24-25]。自噬細胞內p62含量與Beclin-1和LC3II表達水平呈負相關[25-26]。ARs能誘導HepG2細胞內Beclin-1和LC3II蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平下降，從而促進HepG2細胞發生自噬。

綜上所述，ARs能夠有效地抑制人肝癌HepG2細胞生長，起到促進腫瘤細胞凋亡的作用。ARs可能通過上調Bax/Bcl-2的表達來激活Caspase通路進而誘導HepG2細胞發生凋亡。ARs也能通過促進細胞發生過度自噬從而引起細胞死亡，但其誘導自噬與凋亡之間的聯系仍需深入研究。小麥麩皮ARs良好的抗腫瘤活性使其具有良好的開發利用價值。