基于肌漿蛋白質組研究黑切牛肉的形成機制

吳 爽，王 磊，楊嘯吟，羅 欣,2，李 航，朱立賢,，張一敏,2,

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095；3.國家肉牛牦牛產業技術體系豐都綜合試驗站，重慶 408216）

動物的宰前應激是一個非常復雜的特性，受到很多內在因素（如基因、性別和年齡）和外在因素（運輸和管理）的影響[1-2]。宰前應激會消耗動物肌肉內的糖原儲備，進而影響宰后肌肉向食用肉轉變過程中的生化反應進程[3]，其中一個重要的過程是腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的再生和水解。當宰后肌肉供血不足時，肌肉的有氧代謝會轉變為無氧酵解，無氧酵解產生的乳酸和ATP會水解產生H+，H+在肌肉中積累導致肌肉的pH值降低[4]，而宰后肌肉pH值的下降速率和極限pH值對肉的品質有很大影響[5-6]。黑切牛肉的產生通常被認為是由于宰前消耗糖原和牛個體間理化性質差異所導致的，其較高的極限pH值增加了肌肉的保水性和線粒體的活性，導致肉表面的散射光較少，并且脫氧肌紅蛋白含量較高，因此產生較暗的肉色[7-8]。黑切肉的顏色發暗會使其品質大打折扣，降低消費者購買欲；此外，微生物更容易在高pH值肌肉中生長繁殖，導致冷鮮肉的貨架期嚴重縮短[9]。在2000年，美國黑切牛肉的發生率為2.7%，卻給肉類工業造成了1.65～1.72億 美元的經濟損失[10]，而黑切牛肉在我國東北、西北、華北3 個肉牛產區的發生率均比較高，其中山東省黑切牛肉的發生率高達19.2%[11-12]。因此，探明黑切牛肉的發生機制并對其進行控制，對于提高我國肉牛產業的行業競爭力具有重要意義。

屠宰后肌肉向食用肉的轉變，即活體動物組織到最終可食用肉的轉變，是影響肉品質的關鍵過程[13]。基于雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2DE）的蛋白質組學可以鑒定和識別這一轉變過程發生變化的蛋白，從蛋白水平上來研究宰后早期的代謝生化過程，從而更好地解釋肉品質存在差異的內在機制。自21世紀初，利用蛋白質組學來探究牛肉的肉色、嫩度、保水性等品質的變化過程及差異正逐步成為肉品研究領域的熱點，并發現了一些決定肉品品質優劣的關鍵蛋白生物標簽[14-16]。目前，有關肉色蛋白質組的研究多集中于不同部位肉之間以及牛肉在貯藏期間的蛋白質組差異和表達量變化上，同時發現一些代謝酶類、伴侶蛋白、過氧化物還原酶和抗氧化蛋白等是調控肉色穩定性的關鍵蛋白質[17-22]。Gagaoua等[23]利用免疫斑點印跡探究了阿吉斯坦公牛宰后早期與嫩度、pH值下降和顏色有關的蛋白生物標記，發現蘋果酸脫氫酶1、烯醇酶3和乳酸脫氫酶等糖酵解酶與宰后pH值降低和宰后24 h的肉色有關。

牛肉宰后初期的糖酵解和能量代謝等生化進程對牛肉pH值下降速率的影響至關重要，鑒于肌漿蛋白調控著與宰后pH值下降直接相關的生化反應，其在黑切牛肉的形成機制中起著舉足輕重的作用。目前有關不同極限pH值牛肉宰后早期的肌漿蛋白質組的變化尚不明確。有學者研究了宰前應激有關的蛋白質組變化，發現7 種結構收縮蛋白和3 種代謝酶在宰后24 h的正常和黑切胸背最長肌中存在差異[3]。最近還有學者研究了黑切牛肉與正常肉之間宰后24～48 h的蛋白質組學差異，發現熱休克蛋白B1與α-晶狀體蛋白在黑切肉中表達量較高，而過氧化物還原酶則在正常肉中表達量較高[24]。然而，宰后初期（24 h內）作為決定黑切肉形成與否的關鍵時期，對于這一時期正常牛肉與黑切牛肉的差異表達蛋白以及它們變化規律的研究卻鮮有報道。

因此，本研究對宰后45 min和24 h的正常牛肉和黑切牛肉進行了肌漿蛋白質組學分析，擬尋找兩組牛肉在宰后最初（45 min）和24 h時的差異表達蛋白，以便更好地理解黑切牛肉形成的機制，并尋找可預測黑切牛肉發生的關鍵標記蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖 1 典型的黑切牛肉與正常牛肉Fig. 1 Appearance of typical dark cutting beef and normal ultimate pH beef

實驗所用的樣品來自于山東省某企業的魯西黃牛與西門塔爾雜交牛（24 月齡、500 kg左右）。分別在宰后45 min和24 h，測定右半胴體第12～13根肋骨間背最長肌的pH值，并在腰背最長肌的前表面（靠近眼肉一端）取約200 g肉塊，液氮冷凍，-80 ℃保存，用于后續的肌漿蛋白質提取。根據宰后24 h的pH值，將樣品分為正常（pH 5.4～5.8，n＝3）和黑切組（pH＞6.1，n＝3）（典型的黑切牛肉見圖1），每頭牛取兩個平行，因此每組有6 個平行樣品。

尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽、硫脲、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、碘乙酰胺、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、碘代乙酰胺、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍、四甲基乙二胺、瓊脂糖、硫酸銨、考馬斯亮藍G-250 北京索萊寶科技公司；丙三醇、正丁醇、甲醇、無水乙醇、冰乙酸、磷酸 國藥集團化學試劑公司；非干擾型蛋白濃度測定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SenvenGo pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；T18高速分散機、KS 501低平型搖床 德國IKA公司；5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；EPOCH-2全自動酶標儀 美國Bio Tek公司；Ettan IPGphor 3等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳儀、ImageScanner III圖像掃描儀美國通用電氣公司；5800 MALDI-TOF/TOF質譜儀美國SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值的測定

利用便攜式pH計測定右半胴體12～13 根肋骨間肌肉組織的pH值，深度約6 cm，每個胴體測定3 個位置，取其平均值。

1.3.2 肌漿蛋白的提取

參照Joseph等[18]的方法，取2 g樣品，加入5 倍體積的提取液（40 mmol/L Tris base、2 mmol/L EDTA，調pH值至8.0）和120 μL的DTT（2 mol/L），冰浴條件下勻漿（5 500 r/min勻漿30 s后停30 s，共進行4 次），4 ℃下10 000×g離心15 min，取上清液，即為肌漿蛋白，利用非干擾型蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度定量，分裝凍藏（-80 ℃）備用。

1.3.3 雙向凝膠電泳

1.3.3.1 一向等電聚焦電泳

在等電聚焦電泳之前，先對Immobiline Dry Strip干膠條進行上樣水化，上樣量為800 μg（每組的每個樣品單獨進行雙向電泳），水化溶脹時間為24 h。將泡脹好的膠條轉移至Manifold膠條槽內，設定IPGphorIII電泳儀聚焦程序（300 V、1 h；1 000 V、1 h；grd 4 000 V、1 h；10 000 V、2.5 h；grd 10 000 V至80 000 V·h；grd 300 V、10 h），然后對膠條進行等電聚焦電泳。

1.3.3.2 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚焦后膠條分別用含有1 g/100 mL DTT和4.5 g/100 mL碘乙酰胺的平衡緩沖液（6 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS、體積分數30%甘油、0.002 g/100 mL溴酚藍）先后室溫平衡15 min。將平衡好的膠條轉移至提前制好的SDS聚丙烯酰胺凝膠面上，待瓊脂糖封膠液完全凝結后，將裝有SDS聚丙烯酰胺凝膠的膠盒裝入含有電泳液的電泳槽中。設定電泳槽溫度為15 ℃和電泳儀參數為：100 V電泳1 h，然后300 V至溴酚藍指示線即將到達電泳槽底部時關閉電泳儀開關。2DE結束，將聚丙烯酰胺凝膠取出，進行考馬斯亮藍G-250染色，1 g/100 mL醋酸脫色至背景清晰。

1.3.3.3 圖像掃描和質譜鑒定

采用圖像掃描和凝膠圖像分析（PDQuest 8.0軟件）對雙向電泳凝膠上的蛋白點進行檢測分析，找出正常組和黑切組兩組間蛋白表達量相差1.5 倍以上并有顯著差異（P＜0.05）的蛋白點確定為差異表達蛋白。然后對差異表達蛋白的膠點進行質譜分析，數據庫（Uniprot）檢索，確定蛋白種類。

1.4 數據分析

在本實驗中，pH值采用SAS 9.0軟件中混合模型分析，并采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。采用String 10.5軟件進行差異表達蛋白互作分析。

2 結果與分析

2.1 宰后45 min和24 h的pH值

極限pH值與宰后時間的交互作用對肌肉pH值影響顯著。由圖2可知，宰后45 min的正常和黑切牛肉的pH值相似（P＞0.05），宰后24 h兩組肌肉的pH值均顯著降低，但是正常牛肉的pH值（5.59）顯著低于黑切牛肉的pH值（6.54）。

圖 2 正常和黑切組宰后45 min和24 h的pH值Fig. 2 pH of normal pH and dark cutting beef at 45 min and 24 h postmortem

2.2 宰后45 min及24 h正常組牛肉與黑切組牛肉的差異表達蛋白

通過對正常和黑切組宰后45 min（初始點）和宰后24 h樣品的蛋白點分析，共鑒定出26 個差異表達蛋白點，其中宰后45 min有10 個，24 h有16 個（兩個時間點共有的差異點為6 個），這些蛋白點的位置如圖3所示。在宰后45 min的10 個差異表達蛋白點（9 種蛋白）中，有8 種蛋白在正常組中表達量高（以正常組膠圖上的一個蛋白點與黑切組同一蛋白點的強度比值大于1.5 倍或小于0.667 倍且滿足顯著性小于5%（P＜0.05）為差異蛋白，小于0.667 倍為在正常組表達量高），只有1 種蛋白在黑切組中表達量高（大于1.5 倍表示在黑切組表達量高）。這些差異表達蛋白按照其功能可劃分為代謝酶類、抗氧化蛋白、伴侶蛋白和其他蛋白（表1）。其中腺苷酸激酶1、琥珀酸-輔酶A連接酶、肌酸激酶M和磷酸酶屬于代謝酶，參與能量代謝過程?？寡趸鞍装ㄟ^氧化物還原酶1和過氧化物還原酶2。而兩種伴侶蛋白（熱休克蛋白B1和α-晶狀體蛋白），分別在正常組和黑切組中表達量高。此外，還鑒定出一種結構蛋白，為肌球蛋白輕鏈1。

圖 3 宰后45 min和24 h的差異表達蛋白2DE圖Fig. 3 Differentially expressed proteins in beef at 45 min and 24 h postmortem

宰后24 h的16 個差異表達蛋白點鑒定出了14 種蛋白，除腺苷酸激酶1和α-晶狀體蛋白外，其余蛋白均在正常組表達量高。這些差異表達蛋白主要為代謝酶類、抗氧化蛋白、伴侶蛋白、轉運蛋白和結構蛋白，其中所占比例最高的差異表達蛋白為代謝酶類，包括3 種糖酵解酶（肌肉磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶1、磷酸甘油酸變位酶2）和4 種能量代謝酶（琥珀酸-輔酶A連接酶、肌酸激酶M、磷酸酯尿苷基轉移酶、S-腺苷高半胱氨酸水解酶）。本研究鑒定出的3 種抗氧化蛋白包括磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶、氧化物還原酶1、氧化物還原酶2，3 種伴侶蛋白包括熱休克蛋白B1、熱休克蛋白B6和α-晶狀體蛋白。另外3 個差異點中，其中兩個蛋白點均鑒定為轉鐵運蛋白，屬于轉運蛋白的一種，另一個是肌球蛋白輕鏈1，屬于結構蛋白。這些蛋白的具體信息如表1所示。

表 1 宰后45 min及24 h正常組牛肉相對于黑切組牛肉差異表達蛋白Table 1 Differentially expressed proteins in normal pH beef at postmortem 45 min and 24 h when compared with dark cutting beef

在鑒定出的代謝酶中，腺苷酸激酶1、肌酸激酶M、磷酸酶、琥珀酸-輔酶A連接酶、磷酸酯尿苷基轉移酶和S-腺苷高半胱氨酸水解酶參與ATP的合成和代謝過程。腺苷酸激酶-1能夠催化ATP和腺嘌呤核糖核苷酸末端磷酸基的可逆轉移，在維持細胞能量穩態和腺嘌呤核苷酸代謝中起重要作用。Yu Qianqian等[22]比較了宰后早期的牛背最長肌和腰大肌蛋白質組差異，發現腺苷酸激酶1在背最長肌中表達量高于腰大肌，而較高的腺苷酸激酶1表達量可以反映更高的能量代謝水平。肌酸激酶是維持肌肉內能量正常運轉和ATP再生的關鍵酶[19]，當肌肉中ATP被消耗殆盡時，它會催化肌酸磷酸生成ATP和肌酸。Mahmood等[24]發現正常肉中的肌酸激酶M表達量高于黑切肉，與本研究的結果一致。此外，有研究發現肌酸激酶M型與宰后貯藏期間肉的紅度值呈正相關[16,18]，并且肌酸因具有清除自由基的能力而具有抗氧化作用[17]。在呼吸作用降低時，琥珀酸-輔酶A連接酶會調控底物水平磷酸化和三磷酸鳥苷/ATP的產生[4]，它的表達量與肌肉的能量需求有關。Poleti等[25]認為琥珀酸輔酶A-連接酶可以為宰后肌肉的pH值下降提供能量，以促使肌肉維持正常的pH值，并發現它與宰后24 h的pH值呈顯著負相關（r＝-0.576）。另外，本實驗中鑒定出的S-腺苷高半胱氨酸水解酶在核苷酸和核酸代謝中具有重要作用，Wu Wei等[20]則發現它在背最長肌中的表達量高于腰大肌，且與a*值呈正相關。磷酸酯尿苷基轉移酶是參與糖原合成的主要酶，與本實驗結果一致，Poleti等[25]同樣發現這個蛋白在正常組的表達量高于黑切組，并推測它可能有利于糖原的儲備；因此，容易發生黑切肉的動物可能是由于其本身糖原儲備能力低于不易發生黑切肉的動物。本研究鑒定出的兩種糖酵解酶是肌肉磷酸化酶和葡萄糖磷酸變位酶1，其中肌肉磷酸化酶具有糖原磷酸化的作用，催化糖原轉變為葡萄糖-1-磷酸，是糖代謝的關鍵限制酶，調控著宰后能量的主要來源。葡萄糖磷酸變位酶1可以催化葡萄糖-1-磷酸轉變為葡萄糖-6-磷酸，是糖酵解過程中的關鍵酶，它的表達量增加會導致較高的糖酵解活性[14]，這可能會影響宰后牛肉的最終極限pH值。值得注意的是，有兩個蛋白點均為葡萄糖磷酸變位酶，這可能是宰后蛋白質碎片化或翻譯修飾的結果[16,21]。相較于黑切牛肉，這些能量代謝類和糖代謝酶在正常肉中的高表達量，意味著肌肉能量代謝水平更高，產生更多的H+，可以保證宰后pH值的降低和肌肉的正常極限pH值，它們在黑切肉的表達量低可能是黑切肉形成的直接原因，而且琥珀酸-輔酶A連接酶可以作為識別pH值差異的生物標記。

在本研究中，所有的抗氧化蛋白在正常組表達量高。磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶是細胞內必不可少的抗過氧化物酶，它可以直接還原磷脂氫過氧化物，保護細胞膜不受自由基導致的氧化損傷，在保護細胞免受氧化應激反應中起關鍵作用。同時，它還具有谷胱甘肽過氧化物酶的活性，可以通過還原氫過氧化物，降低自由基對一些關鍵酶的損害。有研究發現谷胱甘肽過氧化酶和具有谷胱甘肽過氧化酶活性的過氧化物酶6與牛肉紅度呈正相關[23,26]，這可能有助于揭示正常肉肉色好于黑切肉的內在原因。過氧化物酶又稱硫氧還蛋白過氧化物酶，是一類普遍存在于生物體內的抗氧化蛋白，它通過硫氧還蛋白還原細胞內代謝產生的氫過氧化物，清除超氧化物自由基和降低細胞的氧化應激，具有保護細胞的抗氧化作用[27]。本研究檢測出了過氧化物酶1和過氧化物酶2，這些抗氧化蛋白在宰后45 min正常組的高表達量，表明動物屠宰后正常組快速開始細胞凋亡，產生氧化應激也更為強烈，這可能間接反映正常組代謝水平高于黑切組；另一方面，研究發現硫氧還蛋白過氧化物酶與線粒體呼吸控制速率呈正相關[28]，在本實驗中它的高表達量說明正常組宰后45 min時的呼吸作用更強，間接說明ATP代謝水平更高，更有利于肌肉pH值的降低。此外，Gagaoua等[23]認為宰后45 min抗氧化蛋白表達量較高預示著較低的極限pH值，這與本實驗的結果一致，因此宰后45 min的抗氧化蛋白表達量是影響黑切牛肉形成的關鍵因素之一。

本研究檢測到的兩種小熱休克蛋白（熱休克蛋白B1和熱休克蛋白B6）屬于熱休克蛋白家族的一員，是細胞內重要的伴侶蛋白。研究發現當細胞處于過熱、低氧或有害氧化環境時，小熱休克蛋白（15～43 kDa）表達量就會增加，阻止蛋白發生不可逆聚集和變性，保護和維持細胞內一些重要蛋白酶的結構和功能，以及降低氧自由基，具有保護細胞免受氧化應激和抗細胞凋亡的作用[29]。相較于黑切肉組，小熱休克蛋白B1和B6在正常組中較高的表達量，可能是對宰后牛肉pH值快速降低做出的應答反應。Gagaoua等[23]曾報道宰后45 min較高的小熱休克蛋白B1表達水平間接反映了牛肉的快速代謝，并預示著宰后較低的pH值。Mahmood等[24]也發現熱休克蛋白B1在正常肉的表達量高于黑切肉，這與本實驗的結果一致。此外，檢測到的α(B)-晶狀體蛋白也屬于小熱休克蛋白家族，在機體處于感染、缺氧、應激等狀態下，α(B)-晶狀體蛋白的表達量就會上調。與本研究結果相似，前期研究發現α-晶狀體蛋白在黑切牛背最長肌中的表達量高于正常肉[24,30]，此外，Gagaoua等[23]發現α(B)-晶狀體蛋白與宰后24 h的亮度呈負相關，這正好與黑切肉顏色暗的現象相對應。因此，熱休克蛋白B1和α(B)-晶狀體蛋白可以作為識別黑切牛肉的潛在生物標記。

此外，本研究還檢測到轉運蛋白（轉鐵蛋白）在宰后24 h的正常組中表達量高于黑切組，轉鐵蛋白表達量高可以解釋為當供血不足，對細胞內鐵補償的機制，Sayd等[31]曾報道轉鐵蛋白在更亮的豬肉組中表達量高于暗色豬肉組，并認為其在糖酵解型肌肉中的表達量高。肌球蛋白輕鏈1可以調控肌球蛋白的輕鏈，有研究發現它可以預測宰后24 h的肌肉pH值，其表達量越高預示著極限pH值越低[23]，這與本研究的蛋白質組和pH值的結果一致。

2.3 蛋白質互作分析結果

本研究將檢測到差異表達蛋白和數據庫中與這些差異表達蛋白相關的蛋白進行蛋白質互作預測分析，如圖4所示。與差異表達蛋白連接最多的節點為ATP-檸檬酸合酶（ATP-citrate synthase，ACLY），它可以催化產生乙酰輔酶A和ATP，并參與三羧酸循環和丁酮戊二酸的代謝過程。與ACLY有聯系的差異表達蛋白包括所有抗氧化蛋白和大多數代謝酶，說明這些差異表達蛋白直接或間接參與了能量代謝過程。另外，熱休克蛋白B1和α-晶狀體蛋白兩個伴侶蛋白相互聯系，卻與熱休克蛋白B6分離，說明這兩種熱休克蛋白可能并不參與同一生化反應體系。以上蛋白質互作分析結果進一步印證了代謝酶和抗氧化蛋白可能通過參與能量代謝過程使宰后pH值降低，進而導致黑切肉的形成。此外，ACLY在蛋白互作中的核心位置，表明它可能也參與黑切肉的形成。

圖 4 蛋白質互作網絡預測圖Fig. 4 Predicted protein-protein interaction networks

3 結 論

本研究中，宰后24 h正常組的肌肉pH值為5.59，黑切組的pH值為6.54。正常組和黑切組牛肉在宰后45 min和24 h時的差異表達蛋白主要為代謝酶類、抗氧化蛋白和伴侶蛋白等，除了α-晶狀體蛋白和宰后24 h的腺苷酸激酶1在黑切組表達量高外，其他蛋白均在正常組表達量高。其中代謝酶類可以通過調節ATP的再生代謝與糖酵解進程來影響宰后肌肉中H+的產生和積累，進而影響宰后肌肉pH值的降低速率和最終極限pH值，它們在宰后早期的低表達量是導致黑切牛肉形成的關鍵因素?？寡趸鞍最惐磉_量高，是對宰后代謝水平高的反應，蛋白質互作也說明抗氧化蛋白與能量代謝有關，它們在黑切組中表達量低，進一步說明黑切肉宰后的低代謝水平。熱休克蛋白表達量與宰后氧化應激和不利環境相關，其中熱休克蛋白B1和B6均在正常組中表達量高，而α-晶狀體蛋白在黑切組中表達量高，這也影響了宰后牛肉pH值的下降。綜上所述，本研究發現宰后初期較低的代謝水平是導致黑切牛肉產生的直接原因，可將琥珀酸-輔酶A連接酶、熱休克蛋白B1和α-晶狀體蛋白作為識別黑切肉的候選蛋白生物標記。此外，蛋白質互作圖中的ATP-檸檬酸合酶與多種代謝酶和抗氧化酶有聯系，因此可以對其進行深入研究，探究其與黑切肉形成的直接關系。