幽門螺桿菌感染與胃癌組織中p27蛋白表達的關(guān)聯(lián)性分析

殷曉霞，張 凡

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，河北 張家口 075000)

胃癌是發(fā)生于胃黏膜上皮的一種常見惡性腫瘤，其在胃惡性腫瘤中占95%以上，在消化道惡性腫瘤疾病中占首位[1]。胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡與增殖通常情況下保持動態(tài)平衡，而一些生長因子、癌基因及抑癌基因的共同調(diào)控是維持這種平衡的關(guān)鍵[2]。細(xì)胞周期是一個經(jīng)高度有序、嚴(yán)格調(diào)控的過程，而細(xì)胞的間接分裂對腫瘤細(xì)胞擴增中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，間接分裂的偏差會造成基因組不穩(wěn)定而引發(fā)腫瘤。p27是一個細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，會隨著細(xì)胞周期進展的變化而變化，對于多種細(xì)胞周期激酶和蛋白的活性具有較好的抑制作用，因此p27被認(rèn)為是一種抑癌基因[3]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)于1994年宣布人類胃癌的Ⅰ類致癌原為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，但目前尚不明確H.pylori引起胃癌的發(fā)病機制。本研究旨在探討H.pylori感染與胃癌癌組織中p27蛋白表達的關(guān)聯(lián)性，了解H.pylori感染引起胃癌的發(fā)病機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月—2018年12月在我院行胃癌切除術(shù)的胃癌組織標(biāo)本共62例(胃食管交界46例，遠端組織16例)，其中男性32例，女性30例，年齡34～75歲，平均(59.40±2.10)歲；TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期39例；胃癌組織分化程度：低分化25例，高、中分化37例。所有患者術(shù)前均無服用非甾體抗炎藥物及接受抗H.pylori治療，且臨床資料完整。另選擇癌旁組織(距離腫瘤邊緣2.5～5 cm)標(biāo)本42例,男性20例，女性22例，年齡 35～72歲，平均(58.60±1.80)歲。 胃癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1H.pylori檢測 采用14C-尿素酶呼氣(14C-UBT，)方法，14C-UBT檢測儀為深圳市中核海得威生物科技有限公司生產(chǎn)。患者在空腹6 h后采集100 mL呼氣，服用14C之后再采集100 mL呼氣，密封待檢；將收集的呼氣裝置與C紅外線能譜儀檢測孔連接進行自動檢測，設(shè)備檢測完成之后自動生成檢測報告，其中陽性值為DOB>2.5[4]。病理組織染色處理：采用改良Giemsa染色處理方法，標(biāo)本使用10%甲醛進行固定，梯度乙醇脫水-石蠟包埋-切片(厚度4 μm)，行姬姆薩染色處理。處理步驟[5]：第一步將石蠟切片行常規(guī)脫蠟、脫水處理，然后加入2% Ciemsa染色劑，浸泡30 min；染色完成后使用自來水清洗，迅速使用純酒精脫水及二甲苯處理，促使切片透明，最后行樹膠封固。在油鏡下(×1 000)觀察H.pylori感染情況，看見小桿菌為確診感染。

1.2.2p27蛋白表達檢測 采用福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的快捷法通用型二抗、鼠抗人p27單克隆抗體試劑盒及北京中杉金橋生物技術(shù)生產(chǎn)的氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒[6]。用微波爐進行抗原修復(fù)，按試劑盒說明書進行免疫組織化學(xué)檢測，并由2名專業(yè)病理醫(yī)師進行結(jié)果判定。胃癌組織中細(xì)胞核和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為p27蛋白表達陽性。癌旁組織中細(xì)胞胞核和胞漿中呈明顯棕色顆粒狀為p27表達陽性。免疫組織化學(xué)染色評分根據(jù)以下3個方面進行判定；①陽性細(xì)胞百分比評分:0分，0%；1分，<10%；2分，10%～50%；3分，51%～90%；4分，>90%；②染色密度評分:0分，無染色；1分，弱染色；2分，中染色；3分，強染色；③染色方式評分:0分，無染色；1分，散在染色；2分，局灶染色；3分，彌漫染色。每例標(biāo)本的染色積分=①×②×③，其中陽性為1～36分，陰性為0分。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析應(yīng)用線性相關(guān)性分析，影響因素確定采用多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1H.pylori檢測結(jié)果 62例胃癌患者均行14C-UBT檢測，結(jié)果顯示，H.pylori感染40例，感染率為64.52%。

2.2不同臨床病理特征胃癌患者p27蛋白表達情況比較 高、中分化胃癌患者p27蛋白表達率高于低分化胃癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；不同性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)胃癌患者p27蛋白表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征胃癌患者p27蛋白表達情況比較Table 1 Comparison of p27protein expression in gastric cancer patients with different clinicopathological characteristics (例數(shù)，%)

2.3胃癌癌組織中H.pylori感染與p27蛋白表達的相關(guān)性H.pylori感染與胃癌癌組織中p27蛋白表達呈負(fù)性相關(guān)(P<0.01)。見表2。

表2 胃癌癌組織中H.pylori感染與p27蛋白表達的相關(guān)性Table 2 Correlation between H.pyloriinfection and p27protein expression in gastric cancer tissues (例數(shù))

2.4p27在胃癌組織和癌旁組織中的表達比較 p27在胃癌組織中的表達率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 p27在胃癌組織和癌旁組織中的表達比較Table 3 Comparison of expression of p27in stomach cancer tissue and cancerside tissue (例數(shù)，%)

2.5多因素Logistic回歸分析 以p27蛋白表達(陰性=0，陽性=1)的因變量，以腫瘤分化程度(低分化=0，高、中分化=1)為自變量，進行多因素Logistics回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤分化程度是胃癌組織p27蛋白陽性表達的危險因素(P<0.01)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析Table 4 Multiple logistic regression analysis

3 討 論

H.pylori為一種定植于胃黏膜的革蘭陰性螺旋細(xì)長微彎桿菌[7]。目前，我國H.pylori感染率達50%～80%，且隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，其感染率呈逐漸升高趨勢[8]。H.pylori是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃淋巴瘤的主要原因之一，也是導(dǎo)致胃癌發(fā)生并發(fā)展的Ⅰ類致病源，因其具有強烈的黏附性，且分泌的毒素具有致病性，故極易導(dǎo)致胃黏膜病變，一般癌變順序是由慢性炎癥發(fā)展為萎縮性胃炎，進而發(fā)展到萎縮性胃炎伴腸化，最終發(fā)展為癌變，被WHO列為人類Ⅰ類致癌因子[9]。

通常惡性腫瘤的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果。李曉琴等[10]研究表明，H.pylori感染是胃癌發(fā)生的重要危險因素之一，胃癌患者中約70%與H.pylori感染有關(guān)。H.pylori感染引起的胃癌發(fā)生有多種機制，主要與人體抑癌基因的失活和內(nèi)癌基因的激活及突變有關(guān)，其中抑癌基因主要包括野生型p53、p27、抑癌基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)、結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)等，內(nèi)癌基因主要包括c-myc、ras基因和Bcl-2活化[11]。其中抑癌基因p27是近年來新發(fā)現(xiàn)的CKI基因，屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase in-hibitors，CDK)抑制劑之一，定位于人體內(nèi)部12p13交界處，主要包含1個內(nèi)含子、1個無功能的外顯子和2個有編碼功能的外顯子。研究發(fā)現(xiàn)[12]，p27蛋白可通過作為細(xì)胞外刺激信號的潛在媒介對細(xì)胞周期進行調(diào)控，同時作為調(diào)控細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，還可以抑制細(xì)胞周期素-CDK復(fù)合物的生物學(xué)活性[13]。且通過研究肺癌、乳腺癌和內(nèi)分泌腫瘤，可發(fā)現(xiàn)p27蛋白的表達與腫瘤的生長、分化及預(yù)后密切相關(guān)[14]。此外，p27蛋白表達水平在細(xì)胞周期G1/S的重要轉(zhuǎn)換中降低，則無法阻斷細(xì)胞增殖和分裂，而導(dǎo)致腫瘤形成。據(jù)研究表明[15]，抑癌基因的缺失或減少及細(xì)胞凋亡是癌癥發(fā)生發(fā)展的2個重要因素，作為抑癌基因之一的p27蛋白下降可增加細(xì)胞周期蛋白-CDK2復(fù)合物活性，對細(xì)胞的增殖具有促進作用，最終演變成腫瘤。p27表達在胃癌進展過程中逐漸降低使癌細(xì)胞分化越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更快、惡性程度越高，而導(dǎo)致胃癌的轉(zhuǎn)移或進展。

黃虎等[16]研究發(fā)現(xiàn)，長期慢性H.pylori感染可致p27胞漿錯位，使p27從抑癌轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗颍瑢?dǎo)致胃癌的發(fā)生，并促使了胃癌的進一步發(fā)展。孔凡立等[17]研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染可能影響p27表達，促進胃腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中H.pylori感染與p27蛋白表達呈負(fù)相關(guān)，表明H.pylori感染極易引起胃黏膜抑癌基因p27表達降低或缺失，從而導(dǎo)致胃黏膜癌變發(fā)生。此外，多因素Logistics回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度為胃癌癌組織p27蛋白陽性表達的影響因素。表明p27蛋白表達與腫瘤分化程度有關(guān)。H.pylori感染引起胃癌的機制可能為H.pylori感染導(dǎo)致p27喪失調(diào)控細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子的抑癌作用，還可能為H.pylori感染導(dǎo)致p27降低引起細(xì)胞黏附性和細(xì)胞外基質(zhì)降低，導(dǎo)致腫瘤浸潤并轉(zhuǎn)移[18]。

綜上所述，胃癌的發(fā)生發(fā)展與p27缺失或凋亡減少有關(guān)，p27蛋白表達水平與H.pylori感染存在一定的關(guān)聯(lián)性，p27蛋白可作為臨床診斷胃癌及是否合并H.pylori感染的輔助指標(biāo)，在疾病后期診斷、治療及預(yù)后評估中具有重要價值，值得推廣應(yīng)用。