氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定白酒中的甲醇含量

張菁菁，劉笑笑，王小喬，吳福祥

（蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000）

白酒是中國(guó)特有的一種蒸餾酒，在我國(guó)有上千年歷史[1-2]。白酒生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)自然產(chǎn)生甲醇、乙醇和其他有機(jī)物質(zhì)；由于甲醇和乙醇的沸點(diǎn)接近（分別在64.7 ℃和78.3 ℃），所以白酒中不可避免地含有一定量的甲醇[3]。甲醇是白酒中最主要的有害物質(zhì)，對(duì)人體的毒作用是由甲醇本身及其代謝產(chǎn)物甲醛和甲酸引起的，主要侵害視神經(jīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜受損，視神經(jīng)萎縮，視力減退和雙目失明[4-11]。

2012年以來(lái)，國(guó)內(nèi)白酒行業(yè)先后陷入“酒精勾兌”、“塑化劑”、“基酒外購(gòu)”、“添加劑”等風(fēng)波中，年份白酒問(wèn)題、散裝白酒中毒等質(zhì)量安全事件接連發(fā)生，折射出我國(guó)白酒行業(yè)發(fā)展的諸多問(wèn)題[12]。白酒造假主要在于摻加甲醇、雜醇油等物質(zhì)[13]。有一些不法分子濫用工業(yè)酒精冒充食用酒精，用工業(yè)甲醇直接勾兌成“毒酒”，以牟取暴利，造成酒中甲醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)家規(guī)定的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[14]。而因飲用甲醇含量超標(biāo)的白酒而造成的食物中毒事件仍時(shí)有發(fā)生。因此，建立白酒中甲醇含量的準(zhǔn)確快速檢測(cè)方法很有必要。

目前，檢測(cè)酒類中甲醇的方法有比色法[15-19]、氣相色譜法[20-24]、高效液相色譜法[25]、近紅外光譜法[26]、激光拉曼光譜法[27]、Fourier變換紅外光譜法[28]等，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中甲醇的檢測(cè)方法為氣相色譜法[29]，這些方法存在測(cè)前處理復(fù)雜，靈敏度有限，定性準(zhǔn)確度有待提高、設(shè)備檢測(cè)成本高等問(wèn)題。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測(cè)定》中，對(duì)甲醇的檢測(cè)采用氫火焰離子化檢測(cè)器，由于白酒中揮發(fā)性成分復(fù)雜且沸點(diǎn)較低，在日常檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，因保留時(shí)間相近，甲醇峰常受到乙酸乙酯、乙醇等沸點(diǎn)相似物質(zhì)的干擾，造成基線不穩(wěn)、峰重疊等情況的發(fā)生，故選擇氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法測(cè)定以消除干擾物質(zhì)。

三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器能有效排除雜質(zhì)干擾，提高檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度。因此本研究采用氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)，旨在建立三重四極桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測(cè)甲醇的方法，以期為白酒中甲醇的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（99.8%）、叔戊醇（99.5%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH標(biāo)準(zhǔn)品有限責(zé)任公司；乙醇（色譜純）：德國(guó)Merck有限公司；實(shí)驗(yàn)用水：Milli-Q超純水機(jī)制備。

樣品：青稞酒1批、醬香型白酒6批、濃香型白酒10批、清香型4批、其他香型6批。

1.2 儀器與設(shè)備

7000D-7890B氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；MSE125P-ICE-DU十萬(wàn)分之一天平：瑞士梅特勒-托利多有限公司；移液器：德國(guó)艾本德儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法

甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取甲醇對(duì)照品0.111 36 g于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%）定容制得11.11 mg/mL甲醇儲(chǔ)備液。為研究確定本方法分別在低濃度范圍和高濃度范圍的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，故分別配制低濃度范圍（1號(hào)）和高濃度范圍（2號(hào)）的甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1號(hào)甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：準(zhǔn)確吸取甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%）定容制得11.11 μg/mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別吸取不同含量的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%）定容制得質(zhì)量濃度為0、0.222 2 μg/mL、0.555 5 μg/mL、0.888 8 μg/mL、1.111 0 μg/mL、2.222 0 μg/mL、5.555 0 μg/mL、8.888 0 μg/mL、11.110 0 μg/mL的1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2號(hào)甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：準(zhǔn)確吸取甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%）定容制得1.111 mg/mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別吸取不同含量的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%）定容制得質(zhì)量濃度梯度為0、11.11μg/mL、22.22 μg/mL、44.44 μg/mL、66.66 μg/mL、88.88 μg/mL、111.10 μg/mL、166.60 μg/mL、222.20 μg/mL的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 儀器檢測(cè)條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent DB-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至130 ℃，再以30 ℃/min升至200 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：40∶1；柱流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；掃描類型：MRM動(dòng)態(tài)反應(yīng)監(jiān)測(cè)；前級(jí)離子質(zhì)核比（m/z）：32；產(chǎn)物離子質(zhì)核比（m/z）：31。

1.3.3 樣品處理方法

為簡(jiǎn)化處理方法，減少易揮發(fā)物質(zhì)的損失，本方法直接吸取樣品1.5 mL于進(jìn)樣小瓶中待測(cè)，采用外標(biāo)法定量。

1.3.4 計(jì)算公式

白酒中甲醇含量計(jì)算（測(cè)定結(jié)果按100%酒精度折算）：

X：試樣中甲醇的含量，g/L；ρ：由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中甲醇的質(zhì)量濃度，mg/L；c：試樣的酒精度，%vol；100：按100%酒精度換算；1 000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，取平均值。應(yīng)用SPSS20.0軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)模式的選擇

配制質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用選擇離子監(jiān)測(cè)（select ion monitoring，SIM）模式及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）測(cè)定，分析譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 單離子監(jiān)測(cè)模式下甲醇溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of methanol solution in single ion monitoring mode

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下甲醇溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of methanol solution in multiple reaction monitoring mode

由圖1和圖2可以看出，在SIM模式條件下，2.6 min甲醇峰未檢出，由于溶劑乙醇含量較高、分子結(jié)構(gòu)與甲醇近似、質(zhì)核比相差較小，在氣相色譜圖中是相鄰的兩個(gè)峰，3.0 min的乙醇峰對(duì)甲醇檢測(cè)有較大的干擾；而在MRM模式母離子質(zhì)核比32，碎片離子質(zhì)核比31條件下，2.6 min甲醇峰響應(yīng)值較高，且有效降低乙醇峰的響應(yīng)值，降低了乙醇干擾。

2.2 定量方法的選擇

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測(cè)定》中定量方法選擇內(nèi)標(biāo)法[29]，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為叔戊醇。本實(shí)驗(yàn)室分別采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法分別對(duì)三個(gè)加標(biāo)樣品和一個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測(cè)定白酒中甲醇結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 定量方法對(duì)比結(jié)果Table 1 Comparison of quantitative methods

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍

圖3 1號(hào)（A）及2號(hào)（B）甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of methanol solution No.1 (A) and No.2 (B)

分別配制兩套不同質(zhì)量濃度范圍的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度（μg/mL）對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，得甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）及檢測(cè)范圍、相關(guān)系數(shù)。由圖3可知，本方法測(cè)定甲醇在0.2～10 μg/mL、10～200 μg/mL范圍內(nèi)線性均良好，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，說(shuō)明在低濃度范圍和高濃度范圍都能夠準(zhǔn)確定量分析。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

分別在50 mL容量瓶中添加0.5 mL、5.0 mL 100 μg/mL的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%）定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0 μg/mL、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩個(gè)質(zhì)量濃度分別進(jìn)樣6次，計(jì)算精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均＜5%，重現(xiàn)性好，精密度能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.3.3 檢出限試驗(yàn)

將10 μg/mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)使用液逐步稀釋，當(dāng)稀釋至甲醇質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL時(shí)，峰高為基線噪聲的3倍，于是將0.1 μg/mL作為方法檢出限。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.266—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測(cè)定方法》檢出限7.5 mg/mL相比，國(guó)標(biāo)法檢出限為本方法檢出限的75倍，本方法顯著提高了檢測(cè)靈敏度。

2.3.4 回收率試驗(yàn)

取一空白樣品，添加1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL甲醇質(zhì)量濃度水平的四組白酒做加標(biāo)回收試驗(yàn)，每組做6份平行，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，4組平均回收率分別為89.17%、92.28%、96.63%、98.52%，回收率試驗(yàn)結(jié)果RSD在1.54%～2.39%之間，回收率較高且穩(wěn)定，準(zhǔn)確度符合測(cè)定要求。

表4 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rates tests of method

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)26個(gè)白酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明25批白酒樣品甲醇均小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2757—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蒸餾酒及其配制酒》[30]中規(guī)定的限量值0.6 g/L，而疑似陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值0.6 g/L，其色譜圖見(jiàn)圖4。可見(jiàn)市場(chǎng)上仍存在個(gè)別白酒樣品甲醇含量超標(biāo)的現(xiàn)象。

圖4 某白酒陽(yáng)性樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of a Baijiu postive sample

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定白酒中的甲醇，選定的色譜質(zhì)譜條件為：毛細(xì)管色譜柱Agilent DB-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：40∶1；柱流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：1.0 μL；電子電離源，離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；掃描類型：MRM動(dòng)態(tài)反應(yīng)監(jiān)測(cè)；前級(jí)離子質(zhì)核比（m/z）：32；產(chǎn)物離子質(zhì)核比（m/z）：31。通過(guò)檢測(cè)條件優(yōu)化和方法學(xué)驗(yàn)證，該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，提高了甲醇測(cè)定的靈敏度和抗干擾能力，為白酒中甲醇檢測(cè)、白酒質(zhì)量控制提供了新的方法。