影響不同醬香酒總多酚含量的因素探討

何 菲，先 春

（1.仁懷醬香白酒科研所，貴州 仁懷 564500；2.貴州省產品質量監督檢驗院 仁懷分院，貴州 仁懷 564500）

釀造醬香型白酒小麥中含有微量阿魏酸[1-2]，糯高粱中含有豐富的單寧物質[3]，發酵過程中在微生物酶等諸多因素影響下逐步轉化為難揮發的多酚、半揮發性酚和揮發性酚，賦予了醬香型白酒獨特香氣和口味感官特征[4]。

由于這些酚類物質中含有一個或多個酚羥基，具有一定的抗氧化作用和風味貢獻，一直是酒界熱議的話題[5-6]。白酒的國內外研究中，利用色譜類儀器檢測出了18種揮發性酚類物質，如愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚等[7-9]；11種半揮發性酚類物質，如香草醛、對羥基苯乙酮、水楊酸等[10]；27種難揮發的多酚類化合物，如沒食子酸、二氫黃酮、阿魏酸、槲皮素、楊梅酮等[11-13]。利用福林-酚法直接測定醬香酒的酚類總量及其變化規律等內容則鮮有報道。

本研究利用酚類物質在堿性條件下具有還原性，可將福林酚試劑中的磷鎢鉬酸還原成藍色，藍色深淺與酚類物質的含量成正相關性原理[14]，利用分光光度計在最大吸收波長下測定醬香型白酒中總多酚含量，選用沒食子酸作標準對照品計算其總含量，探討分析不同醬香基酒和成品酒中總多酚的變化規律以及影響因素，并運用IBM SPSS Statistics 25.0進行單因素方差分析，以期為今后的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒樣的收集

仁懷大曲醬香輪次基酒的采集。收集最近3年貴州仁懷境內按照一年一個生產周期、兩次投糧、九次蒸煮、八次發酵、七次摘酒的傳統大曲醬香工藝生產的666個一至七輪次基酒（原酒），詳見表1。

表1 仁懷大曲醬香輪次基酒實驗樣本信息Table 1 Experimental samples information of Renhuai Daqu sauce-flavor rounds base liquor

不同產地醬香工藝成品酒的采集。收集2018年出廠貴州仁懷境內生產的傳統大曲醬香成品酒和其他非傳統大曲醬香成品酒201個酒樣；市場上，隨機購買2018年出廠的12個非仁懷區域生產的醬香成品酒。詳見表2。

表2 不同產地醬香成品酒實驗樣本信息Table 2 Experimental samples information of sauce-flavor Baijiu from different producing areas

1.1.2 藥品與試劑

沒食子酸標準品（CAS：149-91-7，純度≥99.00%）：貴州迪大生物科技有限責任公司；乙醇（色譜純）：默克股份兩合公司；鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰（均為分析純）：天津市津科精細化工研究所；溴水（Br2=3%，分析純）、磷酸（H3PO4≥85%，分析純）：成都市科龍化工試劑廠；鹽酸（36%～38%，分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：天津市光復科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901型雙束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；BS 244S 電子天平：北京塞多利斯儀器系統有限公司；10～100 μL、100～1 000 μL、1～10 mL移液器：艾德本（中國）有限公司；BWS-0510恒溫水槽與水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；DK-98-11電子調溫萬用爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

沒食子酸儲備液（100 mg/L）：精密稱取0.005 0 g（精確至0.000 1 g）沒食子酸標準品，用體積分數為60%vol的乙醇溶液溶解、定容至50 mL，4.0 ℃以下貯存。

沒食子酸標準曲線工作溶液：準確吸取沒食子酸儲備液1.60 mL于10 mL容量瓶中，用體積分數為60%的乙醇溶液定容，得到16.0 mg/L標液，然后依次吸取5.00 mL高濃度標液于10 mL容量瓶中，用體積分數60%的乙醇溶液定容，依次得到16.0 mg/L、8.0 mg/L、4.0 mg/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L、0.5 mg/L和0.0 mg/L的沒食子酸標準工作溶液，現配現用。

1.3.2 試劑的配制

福林-酚（Folin-phenol）顯色試劑：分別稱取鎢酸鈉25.00 g（精確至0.01 g）、鉬酸鈉6.25 g（精確至0.01 g）于200 mL水中，完全溶解后轉入500 mL磨口三角瓶中，分別加入12.5 mL磷酸和25.0 mL鹽酸，攪拌混勻后置于100 ℃水浴鍋中回流2 h，再加入硫酸鋰37.50 g（精確至0.01 g）、適量的水和數滴溴水，敞開置于電爐上使其沸騰15 min，使其溴水完全揮發；冷卻轉入500 mL容量瓶中定容，0.45 μm濾膜過濾后轉入棕色瓶中備用[15]。

碳酸鈉溶液（75 g/L）：稱取無水碳酸鈉37.50 g（精確至0.01 g）溶于250 mL溫水中，攪拌混勻后轉入500 mL容量瓶中定容，0.45 μm濾膜過濾后置于常溫下備用[15]。

1.3.3 樣品的處理與計算

樣品測定條件的摸索：吸取兩個不同質量濃度沒食子酸溶液（標樣01和標樣02）和兩個不同輪次基酒（酒樣01和酒樣02）1.0 mL，加入1.0 mL福林-酚顯色劑，振蕩后靜置3～5 min后，再加入8.0 mL 75 g/L碳酸鈉溶液后，在波長765 nm條件下掃描沒食子酸溶液（掃描間隔0.5 min）；隨后掃描酒樣（沒食子酸標樣溶液）在400～900 nm范圍內的最大吸收波長（掃描波長間隔1 nm）[16]。

樣品含量的測定過程：吸取2.0 mL酒樣（或標準溶液）于25 mL比色管中，加入1.0 mL福林-酚顯色劑，振蕩后靜置3～5 min后，再加入7.0 mL 75 g/L碳酸鈉溶液，振蕩后靜置30.0 min后處理液經0.45 μm微孔濾膜過濾取過濾液（或經3 000 r/min離心5 min取上清液），在波長760 nm處測定其吸光度值，根據標準溶液濃度與吸光度值計算酒樣中總多酚的含量（以沒食子酸含量計）。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的確認

2.1.1 樣品取樣量、檢測波長、顯色時間的確認

圖2 酒樣（沒食子酸溶液）波長掃描曲線Fig.2 Spectral scanning curve of Baijiu samples (gallic acid solution)

由酒樣（標樣）處理液顯色時間掃描曲線（圖1）可知，酒樣01和酒樣02顯色30 min后溶液的吸光度值趨于平衡穩定，標樣01和標02顯色30 min后吸光度值緩慢下降，實驗確定處理液顯色30 min后立刻測定標準溶液的吸光度值，隨后測定酒樣的吸光度值。由酒樣（標樣）處理液光譜掃描曲線（圖2）可知，在波長400～900 nm掃描范圍內，酒樣01、酒樣02、標樣01、標樣02在波長760 nm左右吸光度值達到頂峰，實驗確定測定標樣（酒樣）的波長為760 nm。

2.1.2 標準曲線與線性相關性

配制7個不同濃度梯度的沒食子酸標準溶液，處理后顯色30 min后，在波長760 nm處測定標準溶液的吸光度值，先用2 cm比色皿盛空白溶液校零。以質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標建立標準曲線。其標準曲線回歸方程為A=0.0621C-0.001，相關系數R2=1.000 0，說明線性相關性較好。

2.1.3 方法精密度與準確度

沒食子酸標準溶液精密度試驗結果見表3。從表3可看出，平行試驗6次沒食子酸溶液的測定結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.15%～1.53%，表明精密度良好，滿足相關技術要求。

表3 福林酚法的精密度試驗結果Table 3 Precision tests results of Folin-phenol method

2.1.4 樣品加標回收率

準確吸取樣品2.0 mL于18支具塞比色管中，分成3個濃度組，每組分別添加1.026 mg/L、2.052 mg/L、5.130 mg/L沒食子酸標準溶液，按照上述方法測定其吸光度值，進行6水平試驗計算其回收率，結果見表4。從表4可看出，在選定的酒樣中成倍加入沒食子酸標準溶液后，回收率分別為99.19%、101.53%和101.60%，回收率在90%～110%范圍內，表明準確度良好，滿足相關技術要求。

表4 福林酚法的加標回收率試驗結果Table 4 Results of standard recovery rate tests of Folin-phenol method

通過以上方法試驗（標準曲線、方法精密度、方法準確度、方法回收率）的確認，各項參數均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》標準的附錄要求，說明該方法準確可靠[17]。

2.2 總多酚隨傳統工藝基酒輪次的變化比較

收集最近3年（2015-2016年度、2016-2017年度、2017-2018年度）仁懷境內傳統醬香工藝生產的666個仁懷大曲醬香一至七輪次基酒測定其總多酚含量，利用IBM SPSS Statistics 25.0統計軟件進行單因素方差分析。以基酒的輪次作為因子，總多酚含量作為因變量進行組間兩兩比較（表5），并繪制出波動的箱線圖（圖3）。

由表5可知，通過仁懷傳統大曲醬香輪次基酒總多酚的組間兩兩比較發現，同類子集分析顯示除一輪次基酒和二輪次基的總多酚含量無明顯差異外，其他三輪次基酒、四輪次基酒、五輪次基酒、六輪次基酒、七輪次基酒的總多酚含量存在明顯差異。結合同類子集組間均值和箱線圖（見圖3）分析，總多酚的含量隨著基酒輪次的增加呈上升趨勢，除一、二輪次基酒變化不明顯外，其他輪次基酒總多酚含量呈現明顯的上升趨勢。

表5 仁懷大曲醬香輪次基酒總多酚含量的比較Table 5 Comparison of total polyphenols content in Renhuai sauce-flavor base liquor from different rounds mg/L

圖3 總多酚隨輪次變化的箱線圖Fig.3 Box plot of total polyphenols with rounds changes

通過調研發現，仁懷本地釀酒企業按照TB52/RHJX 002—2015《仁懷大曲醬香酒生產技術規范》標準選用富含單寧的本地優質糯高粱和小麥制得的高溫大曲作為主要釀造原料釀制生產取得一至七輪次基酒，其中特別要求高粱的單寧含量＞1.0%[18]。這些單寧物質主要存在于高粱的果皮中，而發酵堆中的單寧酶能水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和其他化合物[19]；同時，釀酒高粱果皮中含有豐富的游離態酚酸（如阿魏酸、丁香酸、沒食子酸等）和結合態酚酸（如阿魏酸、丁香酸等）[20]；另外，小麥麩皮中還含有微量的酚類物質，小麥原料經熱處理后酚類成分直線上升，其中以阿魏酸、香蘭醛、香蘭酸等為主[1]。又由于醬香傳統工藝采用循環發酵的模式進行蒸餾取酒[18]，逐漸將原料果皮（麩皮）中酚類物質酶解轉化到酒醅中，使得基酒中的總多酚含量隨著輪次的循環逐漸升高。

2.3 不同來源醬香酒總多酚的差異比較

收集（購買）仁懷境內生產201個不同醬香工藝的成品酒和非仁懷境內生產12個具有代表性的醬香酒測定其總多酚含量，利用IBM SPSS Statistics 25.0統計軟件進行單因素方差分析。以工藝（產區）作為因子，總多酚含量作為因變量進行組間兩兩比較（表6），并繪制出波動的箱線圖（圖4）。

表6 不同來源醬香成品酒總多酚含量的比較Table 6 Comparison of total polyphenols in sauce-flavor Baijiu from different sources mg/L

圖4 不同工藝（產區）來源醬香成品酒總多酚箱線圖Fig.4 Box plot of total polyphenols in sauce-flavor Baijiu from different sources (producing areas)

由表6可知，通過不同來源醬香成品酒的總多酚的組間兩兩比較發現，子集2中仁懷境內生產的碎沙工藝醬香成品酒、串香工藝醬香成品酒和非仁懷境內生產的醬香成品酒之間的總多酚含量無明顯的差異；仁懷境內生產的傳統工藝醬香成品酒略高于子集2中成品酒的總多酚含量，而仁懷境內生產其他工藝醬香成品酒的總多酚含量明顯低于子集2和子集3中成品酒的總多酚含量。

通過調研勾兌工序發現，仁懷傳統工藝生產的醬香成品酒分別有一至七輪次基酒按一定的的比例勾兌調味后最終得到醬香成品酒[21]。一般情況下，勾兌時一至七輪次使用的比例依次分別為5%～10%、8%～15%、25%～35%、20%～30%、15%～20%、3%～10%、3%～10%，結合測定的一至七輪次基酒總多酚含量可發現，仁懷傳統工藝醬香酒的總多酚直接受勾兌比例和輪次基酒總多酚含量多寡的影響。另外，為了避免碎沙工藝、串香工藝醬香成品酒單薄、寡淡的風格缺陷，勾兌師在這些工藝的半成品酒中加入傳統工藝生產的一輪次基酒，使酒味甜，放香好；加入傳統工藝生產的七輪次基酒，使酒的糊香好，只要不露頭，也增加了后味[22]，而七輪次基酒的總多酚含量相對較高，這樣直接導致仁懷境內生產的碎沙工藝、串香工藝醬香成品酒中總多酚含量的升高。

通過調研收集的214個酒樣釀造原料和工藝現狀發現，非仁懷境內生產的醬香成品酒使用的釀酒高粱的單寧相對仁懷本地糯高粱的單寧含量要低[23-24]；而仁懷傳統工藝按照標準要求選用本地種植的優質糯高粱，單寧含量相對較高[25]；仁懷碎沙工藝多選用相對便宜的北方糯高粱，這類高粱通常單寧含量相對較低[26]；仁懷串香工藝醬香成品酒以食用酒精為原料，串蒸傳統工藝8次發酵后的丟糟粗糙制得；仁懷其他工藝醬香酒則直接在食用酒精中添加香精香料，并加入少量過剩的傳統工藝生產的一輪次基酒、七輪次基酒和窖底味酒，簡單勾兌調味而成。從原料的使用情況看，原料中的單寧含量存在不同程度的差異，間接影響不同來源醬香成品酒中的總多酚含量。

3 結論

基于紫外吸光度值與醬香酒中總多酚含量的正比關系，在0.50～16.00 mg/L范圍內沒食子酸標準曲線的線性良好（R2=1.000），精密度試驗結果RSD范圍為0.15%～1.53%，加標回收率范圍為99.19%～101.60%，說明樣品處理過程時，總多酚的損失和變化可忽略不計，驗證該方法準確可靠，適合用于測定醬香酒中的總多酚的含量。

通過同類子集比較結合生產調研分析，仁懷大曲醬香輪次基酒中的總多酚主要受原料中單寧等酚類物質含量和蒸煮發酵循環次數的影響，促使蒸餾取得的傳統工藝輪次基酒的總多酚含量呈上升的趨勢；另外，受勾兌和基酒的影響，仁懷傳統工藝醬香成品的總多酚含量略高于別的醬香成品酒。通過分析測定醬香傳統工藝輪次基酒和不同來源醬香成品酒中總多酚含量，可為醬香酒的勾兌調味和工藝（產區）識別提供數據參考。同時，為貯存時間、貯存環境、貯存容器等影響因素的探討奠定基礎。