響應面法優化組成型殼聚糖酶酶解條件

趙 華，樊龍星，張朝正

（天津科技大學 生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業微生物重點實驗室天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

殼寡糖是一類由氨基葡萄糖（glucosamine，GLcN）和N-乙酰-氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine，GLcNAc）通過β-1,4-糖苷鍵連接的低聚糖（聚合度為2～10），通常是由甲殼素和殼聚糖經過化學法、物理法和酶法等水解得到的[1]。殼寡糖具有分子質量低，易被人體吸收，水溶性好和吸濕保濕等[2-3]優于殼聚糖的特性，因此可用于制備飼料[4]和保鮮材料[5-7]等生物制品。殼寡糖具有增強機體免疫調節能力[8-9]、抗氧化[10-12]、抗腫瘤[13-14]、螯合重金屬[11]以及促進植物抗逆和促進生長[15]等都強于殼聚糖的生物活性。

因此，殼寡糖的制備已經成為國內外學者研究的重點。目前，制備殼寡糖的方法有化學法、物理法和酶解法。化學法制備殼寡糖存在后期分離純化降解產物難度大，消耗試劑多和處理復雜等缺點[16]。物理法存在底物利用率低和降解產物得率低等缺點[17]。酶解法因其殼寡糖產量高和酶特異性好等優點被廣泛關注，但也存在試驗成本高、反應條件嚴格和實用性差等缺點[18]。

本研究利用蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）產殼聚糖酶，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法對酶解法制備殼寡糖的工藝進行優化，從而提高殼寡糖的產量，以便進一步為殼寡糖的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）：由天津科技大學微生物菌株保藏中心保藏，保藏編號為TCCC 150018。

1.1.2 化學試劑

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）、殼聚糖（脫乙酰度80%～95%）：國藥集團化學試劑有限公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽（分析純）：北京博奧拓達科技有限公司。

1.1.3 培養基

種子培養基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖10 g/L，調pH值為6.0～6.4，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：酵母浸粉16 g/L，葡萄糖11.5 g/L，K2HPO41.4 g/L，KH2PO40.6 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，吐溫-80 1.2 g/L，NaCl 5.0 g/L，調pH值為6.0～6.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DHP-9272電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；H1850高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 殼聚糖酶制備

每50 mL種子培養基接入一環蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），在30 ℃、160 r/min的條件下培養24 h，得到種子液。以4%的接種量接入發酵培養基中，在30 ℃、160 r/min的條件下發酵48 h，得到發酵液。

發酵液8 000 r/min離心5 min除去菌體，在上清液中加入（NH4）2SO4，不斷攪拌使發酵液中的（NH4）2SO4飽和度達到60%，靜置2 h后，4 ℃、10 000 r/min離心15 min除去雜蛋白，再取上清液，加入（NH4）2SO4使其飽和度達到80%，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，收集沉淀，得到殼聚糖酶，用蒸餾水定容至20 mL，4 ℃儲藏。

1.3.2 氨基葡萄糖標準曲線的繪制

參考李燕等[19]的氨基葡萄糖標準曲線的制作方法，繪制氨基葡萄糖標準曲線。

1.3.3 殼寡糖含量的測定

1%膠體殼聚糖溶液：稱取1 g殼聚糖（脫乙酰度80%～95%）于燒杯中，量取20 mL蒸餾水攪拌溶脹2 min，加入30 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液，搖勻，待溶液透明，用0.2 mol/L的醋酸鈉調pH至5.5，蒸餾水定容至100 mL。

殼寡糖含量測定采用DNS法。每個比色管加入0.8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，另取殼聚糖酶粗酶液0.1 mL于比色管中，空白對照加入0.1 mL滅活酶液，再向各試管中加入1 mL 1%的膠體殼聚糖溶液，在35 ℃水浴鍋中反應30 min，然后實驗組沸水浴10 min，定容比色管中溶液至2 mL，再加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，以空白組為對照，在波長520 nm處測定各試管的吸光度值。按照氨基葡萄糖標準曲線回歸方程計算酶解液中殼寡糖含量。

1.3.4 殼聚糖酶的添加量

按照1.3.3的方法，分別加入0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL和0.25 mL的殼聚糖酶粗酶液，計算酶解液中殼寡糖含量，確定最佳殼聚糖酶添加量。

1.3.5 單因素試驗優化酶解條件

殼寡糖的產量受到酶解pH、溫度、時間和殼聚糖的濃度等條件的影響，本研究以最終殼寡糖的產量（Y）為考察指標，分別以酶解pH值（3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6），酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃），殼聚糖質量分數（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和酶解時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）為影響因素，進行單因素試驗，考察單因素對殼寡糖的產量的影響。

1.3.6 響應面法優化殼聚糖酶解條件

通過單因素試驗初步考察最佳酶解pH值（X1）、酶解溫度（X2）、底物濃度（X3）以及酶解時間（X4）對殼寡糖產量（Y）的影響。然后利用Box-Behnken進行試驗優化設計，試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 氨基葡萄糖標準曲線

以波長520 nm處的吸光度值（x）為橫坐標，氨基葡萄糖的濃度（y）為縱坐標，繪制氨基葡萄糖標準曲線，如圖1所示。由圖1可知，標準回歸方程y=12.719 0x+0.607 6，相關系數R2=0.9997，二者線性關系良好，可用于測定殼寡糖的含量。

圖1 氨基葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucosamine

2.2 殼聚糖酶的最佳添加量

考察最佳殼聚糖酶的添加量對殼寡糖產量的影響，如圖2所示。由圖2可知，在殼聚糖酶的添加量為0.5～2.0 mL時，隨著殼聚糖酶添加量的增加，殼寡糖產量隨之增多；當酶液添加量為2.0 mL時，殼寡糖產量最大，但是當酶液添加量＞2.0 mL后，隨著添加量的增多，殼寡糖的產量幾乎不再變化。因此，殼聚糖酶最佳的添加量為2.0 mL。

圖2 殼聚糖酶添加量對殼寡糖產量的影響Fig.2 Effect of chitosanase addition on chitosan oligosaccharide yield

2.3 殼聚糖酶酶解條件優化

2.3.1 酶解pH值對殼寡糖產量的影響

酶的活性受pH的影響主要是pH會使酶的活性中心發生結構變化，會解離酶的中心結構基團，限制酶與底物的結合，pH還決定氨基在反應體系中形成R-NH2或R-NH3+[20]。考察殼聚糖酶在pH為3.6～5.6的酶解效率，結果見圖3。

圖3 酶解pH值對殼寡糖產量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis hydrolysis pH on chitosan oligosaccharide yield

由圖3可知，酶解pH為3.6～4.0時，殼聚糖酶受pH影響較大，幾乎不降解殼聚糖；當酶解pH值為4.0～5.6，隨著pH值的增大，殼寡糖的產量也隨之增大；當pH達到5.6時，降解效果達到最佳；當酶解pH值＞5.6時，溶液中會出現白色絮狀不溶物質，又會影響酶解效率。因此，酶解pH值為5.6為宜。

2.3.2 酶解溫度對殼寡糖產量的影響

酶解溫度對酶的影響在于酶解溫度過低會降低酶的活性，影響酶解反應的進行。酶解溫度適合，酶會達到最佳酶解效果。當溫度再持續升高，一定程度會導致酶的結構發生變化而失活，一般溫度對酶活性的影響呈現出鐘罩形[21]。不同酶解溫度對殼聚糖酶降解能力影響結果如圖4所示。

由圖4可知，當酶解溫度為30～50 ℃時，殼寡糖的含量隨著酶解溫度的升高而升高；當酶解溫度為50 ℃時，殼寡糖含量最高，為16.603 μmol/mL；當酶解溫度高于50 ℃之后，殼寡糖含量隨著酶解溫度升高而降低。因此，殼聚糖酶降解的最佳溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對殼寡糖產量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis hydrolysis temperature on chitosan oligosaccharide yield

2.3.3 底物濃度對殼寡糖產量的影響

不同殼聚糖質量分數下殼聚糖酶降解能力結果如圖5所示。由圖5可知，當殼聚糖質量分數為0.5%～2.0%時，隨著殼聚糖質量分數的升高，殼寡糖產量也增多；當殼聚糖質量分數為2.0%時，殼寡糖產量最高；當殼聚糖質量分數＞2.0%之后，殼寡糖產量隨之下降。因此，最佳的殼聚糖質量分數為2.0%。

圖5 殼聚糖質量分數對殼寡糖產量的影響Fig.5 Effect of chitosan mass fraction on chitosan oligosaccharide yield

2.3.4 酶解時間對殼寡糖產量的影響

圖6 酶解時間對殼寡糖產量的影響Fig.6 Effect of enzymolysis hydrolysis time on chitosan oligosaccharide yield

不同酶解時間對殼寡糖產量的影響結果如圖6所示。由圖6可知，在酶解時間為30～150 min時，隨著酶解時間的延長，殼寡糖產量隨著時間的延長而增多；當酶解時間為150 min時，殼寡糖產量最大，但是當酶解時間＞150 min后，隨著時間延長，殼寡糖的產量幾乎不再變化。因此，殼聚糖酶降解殼聚糖的最佳酶解時間為150 min。

2.3.5 響應面法優化殼聚糖酶酶解條件

在單因素試驗基礎上，利用Design Expert 10.0 進行響應面試驗，考察最佳酶解pH值（X1）、酶解溫度（X2）、底物濃度（X3）以及酶解時間（X4）對殼寡糖產量（Y）的影響，對其結果進行優化和響應面分析，所得試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments

通過Design Expert V10.0軟件對表2數據進行回歸分析，得到的多元二次回歸方程為：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，該模型P值＜0.000 1，極顯著（P＜0.01），失擬項P=0.928 6＞0.05，表明失擬項不顯著，即模型和試驗擬合較好。模型決定系數R2為0.990 4，校正后模型的決定系數為0.980 9，變異系數（coefficient of variation，CV）為1.785 0%，表明該模型只有1.785 0%的變異不能由該模型解釋，信噪比為34.056 9，說明試驗操作與模型可信。在該模型中一次項X1、X2、X3、X4、二次項及交互項X2X3、X2X4對殼寡糖產量影響極顯著（P＜0.01）；交互項X1X2對殼寡糖產量影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X3、X1X4、X3X4對殼寡糖產量影響不顯著（P＞0.05）。

2.3.6 響應面分析

綜上所述，該模型可用于解釋試驗結果并進行預測，由回歸分析和回歸方程擬合可以繪制出各因素相互作用的響應面及等高線，結果見圖7。

由圖7可知，殼聚糖最佳酶解條件為酶解pH值5.66、酶解溫度53 ℃、殼聚糖質量分數2.09%、酶解時間157 min，該條件下殼寡糖產量理論值可達35.81 μmol/mL。為了檢驗響應面分析的可靠性，考慮到殼聚糖溶解度的問題，將pH值調至5.6，并在此條件下進行驗證試驗，反應終止后殼寡糖濃度可達35.73μmol/mL，與模型預測值35.48μmol/mL接近。

圖7 各因素交互作用對殼寡糖產量影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on chitosan oligosaccharide production

3 結論

在單因素試驗基礎上，利用響應面法對殼聚糖酶的酶解條件進行優化，最終確定最優酶解條件：酶解pH值為5.6，酶解溫度為53℃，殼聚糖質量分數為2.09%，酶解時間為157 min。在此優化條件下，殼寡糖的產量為35.73 μmol/mL，與預測值接近，說明所建模型可以很好的預測殼寡糖的產量。