直投式納豆菌發酵劑制備工藝優化

魯 青，嚴美婷，張超鳳，張 良

（江西省食品發酵研究所，江西 宜春 336000）

納豆菌（Bacillus natto）是從日本傳統食品納豆中分離出來的無病原性的安全菌株[1]，其發酵作用能使蛋白質等營養成分分解為更利于消化吸收的小分子化合物[2-3]，并產生納豆激酶等多種生理活性物質，從而使發酵食品表現出獨特的營養特點和生理功能[4-7]。故長期以來納豆菌在食品發酵領域占領著重要的位置，成為研究的熱點。

直投式納豆菌發酵劑發酵性能強，使用方便，其不僅能簡化納豆制品生產工藝，還可防止菌種退化及污染，有利于保證產品質量的穩定[8-11]。但目前直投式納豆菌發酵劑的制備技術較復雜，一般要先將納豆菌高密度培養后收集菌體，再添加保護劑后通過噴霧干燥或真空冷凍干燥而成[12-14]，制備工藝復雜、周期長、成本高。因此尋找工藝簡便、成本低的直投式納豆菌發酵劑制備技術是研究的重要方向。

本研究以大米粉為基質替代傳統的液態種子液培養基擴大培養納豆菌，通過單因素試驗及正交試驗優化其培養條件，并將培養物直接烘干制成納豆菌發酵劑，以期得到一種活菌數高、發酵活力強且制備簡便、生產成本低的直投式納豆菌發酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌（Bacillus natto）（CICC 10023）：江西省食品發酵研究所微生物實驗室；大米粉：市售；蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；尿素、硫酸銨（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

營養肉湯培養基[15]：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min。大米粉培養基[16]：將過80目篩的大米粉裝入三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QYC-2102恒溫培養振蕩器：上海新苗醫療器械制造有限公司；LDZF-75KB高壓滅菌鍋、GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱：上海申安醫療器械廠；DH3600電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 直投式納豆菌發酵劑制備工藝流程及操作要點

培養基制備→種子液制備→接種→發酵培養→烘干→發酵劑

操作要點：

（1）培養基的制備：向滅菌的大米粉培養基中添加適量的氮源，再加入適量無菌水，混勻、備用。

（2）種子液：將納豆菌接種于營養肉湯培養基中，在35 ℃、150 r/min條件下活化16 h，即得種子液[17]。

（3）接種、發酵培養：將納豆菌種子液按一定的接種量接入制備好的培養基中，在一定溫度靜置發酵培養一段時間。

（4）烘干：將培養物裝入無菌信封中，置于烘箱中先以45 ℃干燥6 h，再以60 ℃干燥12 h，拍散，即得直投式納豆菌發酵劑。

1.3.2 氮源種類對納豆菌生長的影響

以大米粉為基質增殖納豆菌，向大米粉培養基中分別添加1.0%的大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨，再加入35%無菌水，以3%（V/V）的接種量接入納豆菌種子液，在37 ℃條件下靜置培養24 h，將其裝入無菌信封中，置于烘箱中烘干制成直投式納豆菌發酵劑。采用平板菌落計數法[14]測定發酵劑中納豆菌活菌數，考察氮源種類對納豆菌生長的影響。

1.3.3 氮源含量對納豆菌生長的影響

在最佳氮源條件下，向大米粉培養基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的氮源，其他條件保持不變，對納豆菌進行培養，并烘干制成直投式納豆菌發酵劑。測定發酵劑中納豆菌活菌數，以確定最佳氮源含量。

1.3.4 直投式納豆菌發酵劑發酵條件優化單因素試驗

選取最適氮源及其含量添加于大米粉培養基中，接入納豆菌種子液，在一定條件下進行固態擴大培養，分別考察接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、加水量（25%、30%、35%、40%、45%）、培養時間（20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h）、培養溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）對納豆菌生長的影響。將培養物烘干制成直投式納豆菌發酵劑，測定發酵劑中納豆菌活菌數，以確定最佳培養條件。

1.3.5 直投式納豆菌發酵劑發酵條件優化正交試驗

以單因素試驗為基礎，選取對納豆菌生長影響較大的接種量（A）、加水量（B）、培養溫度（C）及培養時間（D）4個因素進行正交試驗，以發酵劑中納豆菌活菌數為評價指標，得到最佳直投式納豆菌發酵劑制備工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 直投式納豆菌發酵劑發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of directed vat set Bacillus natto starter culture

1.3.6 數據處理

每個試驗做3個平行，結果取平均值，并采用DPS v6.55和Excel 2007軟件處理分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 氮源種類對納豆菌活菌數的影響

圖1 氮源種類對納豆菌活菌數的影響Fig.1 Effect of nitrogen source types on the viable count of Bacillus natto

由圖1可知，不同種類的氮源對納豆菌生長的影響不同，與對照組（未添加氮源的大米粉培養基）相比，有機氮源的添加促進了納豆菌的生長，其中以添加了蛋白胨的大米粉培養基培養納豆菌得到的活菌數最多，干燥后制成的發酵劑中活菌數達6.86×108CFU/g，而無機氮源不利于納豆菌的生長，活菌數較低，這與李情敏等[17]的研究結果一致。因此，確定最佳氮源為蛋白胨。

2.2 蛋白胨添加量對納豆菌活菌數的影響

圖2 蛋白胨添加量對納豆菌活菌數的影響Fig.2 Effect of peptone addition on the viable count of Bacillus natto

由圖2可知，隨著大米粉中蛋白胨添加量的增加，納豆菌活菌數呈先增大后減小的趨勢，當蛋白胨添加量為1.5%時，培養基營養物質豐富，菌體生長旺盛，將培養物烘干后制成的發酵劑中活菌數最高，達9.04×108CFU/g。因此，確定最佳蛋白胨添加量為1.5%。

2.3 接種量對納豆菌活菌數的影響

圖3 接種量對納豆菌活菌數的影響Fig.3 Effect of inoculum on the viable count of Bacillus natto

由圖3可知，不同接種量對納豆菌生長的影響不同，隨著接種量的增大，納豆菌活菌數呈先增大后減小的趨勢，分析原因可能是接種量過小，遲緩期延長，菌體生長代謝慢，接種量過大，菌體生長過快，造成菌體提前衰亡[18]，活菌數降低。當接種量為4%時，最有利于納豆菌的生長，活菌數達最高，為1.17×109CFU/g。因此，確定最佳接種量為4%。

2.4 加水量對納豆菌活菌數的影響

圖4 加水量對納豆菌活菌數的影響Fig.4 Effect of water addition on the viable count of Bacillus natto

由圖4可知，隨著加水量的增加，納豆菌活菌數呈先增大后減小的趨勢，其原因可能為加水量過小時，納豆菌能利用的水分過少，抑制了納豆菌的生長繁殖，而加水量過大時，氧氣供應量不足，造成納豆菌生長狀況不佳[19]，當加水量為35%時，菌體生長最旺盛，活菌數最高，為9.04×108CFU/g。因此，確定最佳加水量為35%。

2.5 培養時間對納豆菌活菌數的影響

由圖5可知，培養時間對納豆菌的生長影響較大，培養時間＜32 h之前，納豆菌活菌數隨著培養時間的增加而增加，繼續延長培養時間，活菌數反而降低，可能是由于培養時間過長，代謝產物積累，造成菌體死亡。當培養時間為32 h時，活菌數達到最大，為1.25×109CFU/g。因此，確定最佳培養時間為32 h。

圖5 培養時間對納豆菌活菌數的影響Fig.5 Effect of culture time on the viable count of Bacillus natto

2.6 培養溫度對納豆菌活菌數的影響

溫度對微生物的生長代謝有重要影響，其會影響菌體細胞內各種酶的活性及蛋白質等物質的合成[20]，進而影響菌體細胞的生長。

圖6 培養溫度對納豆菌活菌數的影響Fig.6 Effect of culture temperature on the viable count of Bacillus natto

由圖6可知，納豆菌活菌數隨著培養溫度的升高呈先增加后降低的趨勢，分析原因可能是溫度過低，納豆菌生長緩慢，溫度太高，菌體過早衰亡。當培養溫度為40 ℃時，最有利于納豆菌的生長，活菌數最高，達1.04×109CFU/g。因此，確定最佳培養溫度為40 ℃。

2.7 直投式納豆菌發酵劑發酵工藝優化正交試驗結果

對正交試驗所得數據進行分析處理，正交試驗結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

由表2可知，影響納豆菌活菌數的主次因素依次為接種量＞加水量＞培養時間＞培養溫度。由表3可知，接種量及加水量對納豆菌活菌數的影響極顯著（P＜0.01），培養時間對納豆菌活菌數的影響顯著（P＜0.05），培養溫度對納豆菌活菌數的影響不顯著（P＞0.05）。故由極差分析和方差分析結果可知，納豆菌生長的最優培養條件組合為A2B3C3D1，即接種量4.0%、加水量40%、培養溫度43 ℃、培養時間28 h。在此最優發酵條件下，最終制得的直投式納豆菌發酵劑中納豆菌活菌數含量達4.71×109CFU/g，高于張雯等[21]采用噴霧干燥制備的納豆菌菌劑（6.5×108CFU/g），該直投式納豆菌發酵劑達到了市售發酵劑的標準要求[22]。因此，確定直投式納豆菌發酵劑的最佳培養條件為接種量4.0%、加水量40%、培養溫度43 ℃、培養時間28 h。

表2 直投式納豆菌發酵劑發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of directed vat set Bacillus natto starter culture

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結論

本研究以添加1.5%蛋白胨的大米粉替代傳統的種子液培養基培養納豆菌，通過單因素及正交試驗優化納豆菌的培養條件，得出納豆菌的最佳培養條件為接種量4.0%、加水量40%、培養溫度43 ℃、培養時間28 h。在此優化條件下，納豆菌生長良好，菌體量多，將培養物烘干后制成的直投式納豆菌發酵劑中的活菌數含量達4.71×109CFU/g。該納豆菌發酵劑達到了市售發酵劑的標準要求，采用此技術制備直投式納豆菌發酵劑可簡化生產過程，對設備要求低，成本低，因此市場前景廣闊。