濃香型白酒中己酸檢測方法研究

季 方，張士陽，吳建峰，左文霞，孫 瑩，唐群勇，桂 翔

（江蘇今世緣酒業股份有限公司，江蘇 漣水 223411）

2015年8月25日，全國白酒標準化技術委員會濃香型白酒分技術委員會在成都完成了對《濃香型白酒》國家標準送審稿的審定工作。在此次標準修訂工作中，最引人注目的一項變動就是將己酸和己酸乙酯的含量進行合并計算代替原標準中的己酸乙酯含量。在濃香型白酒中，酸類和酯類物質是白酒風味物質的重要骨架部分，其中己酸乙酯更是濃香型白酒的主體香味物質[1]，也是衡量、驗證濃香型白酒質量優劣的關鍵理化指標。隨著我國白酒消費逐步走向多樣化，酒類正朝著中低度、營養、優質方向發展，在中低度白酒生命周期中，己酸乙酯水解現象成為了一個普遍存在的技術問題[2]。己酸乙酯水解與己酸酯化反應同時存在于酒體之中，二者相互轉化方向受各種因素的影響不斷移動直至達到動態平衡。在中低度酒中，由于乙醇含量較低的緣故使己酸乙酯水解反應更容易發生。隨著貨架期儲存時間的延長和儲存條件的變化，老酒體中己酸乙酯含量較新酒體會不可避免地下降，己酸含量則會上升[3]。如按照舊標中的規定，老酒中己酸乙酯含量就有可能低于標準規定以下，從而被判定不合格。針對這一問題，新標準以“己酸＋己酸乙酯”代替了“己酸乙酯”，用濃度之和的理化指標要求規避了二者濃度尤其是己酸乙酯濃度不穩定的現象，從而在一定程度上保障了老酒的“合法權益”。

除了己酸，白酒中還含有其他多種有機酸，這些酸類物質不僅能賦予白酒豐滿和酸刺激感，而且還是很多酯類物質的重要前體物質。目前行業中關于白酒的風味物質成分有大量的研究[4-9]，眾多的前處理方法和儀器分析技術被用來分析白酒中的風味成分[10-18]。隨著《濃香型白酒》國家標準的修訂工作逐步推進，建立一種準確、高效分析白酒中己酸含量的方法便成為了一項重要任務。

氣相色譜（gas chromatography，GC）是現階段白酒微量分析中最常用的技術。作為一種封閉系統色譜，其受外界影響較小，分離性能高、分析速度快、靈敏度也很高。氣相色譜直接進樣法是一種酒樣不經處理或簡單處理后就直接進入氣相色譜分析方法，避免了樣品處理過程中物質損失，具有良好的重現性和檢測準確性。基于氣相色譜的氫火焰檢測器（flame ionization detector，FID）分析方法是目前最常見的白酒中微量成分定量方法，能夠對包括己酸在內的眾多成分進行準確分析。并且氣相色譜直接進樣法可以同時測定己酸、己酸乙酯等，尤其適合企業和檢測機構作為白酒質量常規檢測方法。但是相對于醇類、酯類組分，己酸的極性較強，沸點較高，因此對色譜系統，如色譜柱、襯管等有比較高的要求，需要采用特殊改良的聚乙二醇色譜柱來防止普己酸峰拖尾。高負荷的色譜柱同樣會使己酸峰逐漸拖尾，影響測定的準確度。劉莎等[19]建立了氣相色譜-FID檢測器分析白酒中22種風味物質的分析方法。在選定的色譜條件下，采用Agilent 19091N-213安捷倫色譜柱，己酸工作曲線相關系數≥0.999，平均加標回收率為108.1%，精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.9%。檢出限達到了0.5 mg/mL。吳麗華等[20]利用LZP-930型白酒毛細管色譜柱，采用氣相色譜法對白酒中29種微量成分進行色譜分離條件優化，建立了白酒中微量成分毛細管氣相色譜分析方法。在選定的色譜條件下，己酸加標回收率達到了99.0%。胡國英等[21]建立一種毛細管氣相色譜法測定白酒中有機酸類組分含量的方法。選擇DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）毛細管氣相色譜柱，通過優化氣相色譜分離條件，采用內標標準曲線法進行定量。結果表明各有機酸類物質相關系數均＞0.999，己酸為0.999 59，回收率88.0%～98.0%，精密度試驗結果RSD為1.83%。

現行白酒中的己酸檢測受色譜柱或儀器性能等方面的影響，如完全按照《濃香型白酒》報批稿中的條件進行檢測，檢測結果誤差較大。本研究將結合實際工作和實驗條件，將對己酸檢驗方法進行優化改進。采用毛細管氣相色譜分析聯合內標法，通過對升溫方式和速率、進樣口溫度、載氣流量、分流比、進樣量等色譜條件的優化，以期建立適用于準確、快速測定濃香型白酒中己酸含量的檢測方法。通過開展精密度試驗及不同加標水平下的己酸加標回收試驗，對該檢測方法的可行性進行確認。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；2-乙基丁酸（純度≥99.9%）、己酸（純度≥99.5%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

試驗酒樣（1號酒樣38%vol、2號酒樣40%vol、3號酒樣42%vol、4號酒樣52%vol）：江蘇今世緣酒業股份有限公司的成品酒。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890B氣相色譜儀（配備毛細管柱分流/不分流進樣系統及10 μL自動進樣器）、氫火焰離子化檢測器、CPWax 57CB（50 m×0.25 mm，0.20 μm）色譜柱：美國Agilent公司；BSA124S電子天平：德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

乙醇溶液（體積分數50%）：量取50 mL無水乙醇，用水定容至100 mL，混勻。

己酸標準儲備液（43.500 mg/mL）：準確稱取4.350 g（精確至0.001 g）己酸至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，混勻，0～4 ℃低溫冰箱密封保存。2-乙基丁酸標準溶液（體積分數2%）：吸取2 mL2-乙基丁酸至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至100 mL，混勻，0～4 ℃低溫冰箱密封保存。己酸系列標準工作液：分別吸取14.368 μL、28.736 μL、57.472 μL、114.944 μL、172.414 μL、229.888 μL己酸標準儲備液于6個10 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，依次配制成己酸含量為0.062 5 mg/mL、0.125 0 mg/mL、0.250 0 mg/mL、0.500 0 mg/mL、0.750 0 mg/mL、1.000 0 mg/mL系列標準溶液，現配現用。

1.3.2 色譜條件

初始條件依據《濃香型白酒》國家標準（報批稿）附錄B.1氣相色譜法（第一法，仲裁法）設定：

柱溫：初始溫度35 ℃保持1 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，以15 ℃/min升至210 ℃，保持6 min；檢測器溫度：250 ℃；進樣口溫度：250 ℃；載氣流量：1 mL/min；進樣量：1.0 μL；分流比：20∶1。

實驗過程中，分別采取改變升溫方式和速率、進樣口溫度、載氣流量、分流比、進樣量單一條件的方式來評價對己酸分離條件的影響。根據綜合判斷評比得出相對報批稿更為優化的檢測條件：

柱溫：初始溫度45 ℃保持8 min，以4 ℃/min升至130 ℃，以20 ℃/min升至200 ℃，保持15 min；檢測器溫度：250 ℃；進樣口溫度：200 ℃；載氣流量：0.8 mL/min；進樣量：0.5 μL；分流比：40∶1。

1.3.3 標準曲線的繪制

分別吸取10 mL己酸系列標準工作液于6個試管里，然后加入0.1 mL2-乙基丁酸標準溶液，混勻，測定己酸和內標2-乙基丁酸色譜峰面積，以己酸系列工作液的濃度為橫坐標，以己酸和2-乙基丁酸色譜峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 定性定量檢測

調整Agilent 7890B氣相色譜儀器至最佳工作狀態，待儀器穩定后，吸取10 mL試樣于試管中，加入0.1 mL 2-乙基丁酸標準溶液，混勻，進樣檢測。根據已知的己酸標準品在色譜圖上的保留時間對白酒中的己酸進行定性分析，同時記錄己酸和2-乙基丁酸色譜峰面積的比值，根據標準曲線得到試樣中己酸的濃度。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化及定性檢測

完全按照報批稿附錄B中的色譜條件對己酸標樣和2-乙基丁酸標樣進行測定，結果如圖1所示，采用優化后的色譜條件進行測定，結果如圖2所示。由圖1可知，己酸色譜峰的峰型較差，且色譜圖出現明顯的基線漂移，影響積分面積，進而影響數據的準確性。由圖2可知，己酸色譜峰的峰型較好，同時基線漂移情況有明顯改善。

將加過2-乙基丁酸內標的酒樣注入氣相色譜儀中，經檢測，酒樣中的己酸和2-乙基丁酸的保留時間分別為35.413 min和34.288 min，標樣中己酸和2-乙基丁酸的保留時間分別為35.415 min和34.292 min，相對偏差分別為0.003%和0.006%，色譜峰保留時間匹配度較好。

圖1 色譜條件優化前己酸和內標的色譜圖Fig.1 Chromatogram of hexanoic acid and internal standard before chromatographic conditions optimization

圖2 色譜條件優化后己酸的色譜圖Fig.2 Chromatogram of hexanoic acid internal standard after chromatographic conditions optimization

表1 己酸和內標的保留時間差異Table 1 Difference of retention time between hexanoic acid and internal standard

2.2 校準曲線

圖3 己酸的標準曲線Fig.3 Standard curve of hexanoic acid

以配制的己酸標樣與2-乙基丁酸濃度之比為橫坐標，以己酸標樣和2-乙基丁酸色譜峰面積的比值為縱坐標，繪制己酸標準曲線，如圖3所示。根據GB/T 27404—2008附錄F技術要求，對于確認方法，校準曲線的相關系數≥0.99，該實驗做出的校準曲線的相關系數為0.999 74，達到了國標GB/T 27404—2008的技術要求。

2.3 精密度試驗

在優化的色譜條件下，對4個白酒樣品分別進行6次平行檢測，計算測定結果的平均值及相對標準偏差（RSD），結果見表2。由表2可知，4個白酒樣品中的己酸測定結果RSD分別為1.317%、2.020%、1.999%、3.532%，表明采用優化后的色譜條件測定結果精密度良好。

表2 精密度試驗結果（n=6）Table 2 Results of precision tests (n=6)

2.4 加標回收試驗

分別向裝有10 mL酒樣的試管中加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL己酸標準儲備液（濃度為43.500 mg/mL），按照優化的氣相色譜條件，平行測定6次，計算平均回收率。加標測試結果見表3。由表3可知，在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL三個加標水平下，1號酒樣的平均回收率分別為96.1%、98.2%、102.9%，2號酒樣的平均回收率分別為101.1%、98.9%、101.9%，3號酒樣的平均回收率分別為99.4%、99.6%、101.3%，4號酒樣的平均回收率分別為102.8%、99.2%、101.0%，表明采用優化后的條件測定結果準確度良好。

表3 加標回收率試驗結果（n=6）Table 3 Results of adding standard recovery rate tests (n=6)

3 結論

該方法運用毛細管柱氣相色譜儀，依據《濃香型白酒》國家標準（報批稿）附錄B《白酒中己酸含量的測定方法》中氣相色譜法（第一法仲裁法），通過對色譜條件的優化，建立了濃香型白酒中的己酸的檢測方法。采用標準物質和保留時間進行物質的定性，以內標法和多點校正進行白酒中己酸含量的檢測。參照GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F要求，在該方法檢測條件下，己酸的精密度試驗結果相對標準偏差在0.132%～0.353%之間，回收率在96.1%～102.9%之間（n=6），符合GB/T 27404—2008檢測方法確認的技術要求，說明建立的測定白酒中己酸的方法符合《濃香型白酒》國家標準的要求，可以用于濃香型白酒中的己酸含量的檢測。