沙果果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究

于 斌，陳 娟，張世鵬，王子寒

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院 食品系，山東 煙臺(tái) 265713；2.煙臺(tái)南山莊園葡萄酒有限公司，山東 煙臺(tái) 265706）

沙果（Malus asiatica）又名花紅，屬薔薇科蘋果屬植物，在我國(guó)東北和內(nèi)蒙古等地區(qū)栽培廣泛[1]。其果實(shí)形似蘋果，成熟沙果口感酸甜，富含糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、單寧、維生素和鉀、鈉、鎂、鐵、鋅等礦物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-3]。沙果性味甘涼，具有生津潤(rùn)燥、澀精止瀉、清火明目、殺蟲解毒的功效[4]。沙果中的多酚物質(zhì)具有天然抗氧化能力，能有效清除羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基，可減輕氧化損傷，具有防癌、抑制衰老、改善血液循環(huán)等功效[5-7]。目前沙果加工業(yè)相對(duì)落后，僅在產(chǎn)地部分鮮食消費(fèi)或加工成低附加值的沙果干、沙果醬，造成沙果資源的大量浪費(fèi)[8]。因此本試驗(yàn)以新鮮沙果為原料釀制沙果果酒，優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，并考察其抗氧化活性，以期有效利用沙果資源，降低沙果損失率，提高沙果的產(chǎn)業(yè)價(jià)值，為野生、低值果品的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙果、白砂糖：市售；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、次甲基藍(lán)、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、福林酚試劑、檸檬酸、沒(méi)食子酸、碳酸鈉、甲醇、DPPH（均為分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722-P型數(shù)顯分光光度計(jì)：上海現(xiàn)科分光儀器有限公司；WD-9415C型超聲波清洗器：北京六一生物科技有限公司；FA2004型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JYZ-D51榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；MYT-II型糖度計(jì)：上海光華儀器儀表廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙果果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)[9]

沙果→挑選→去梗→清洗→榨汁→護(hù)色→過(guò)濾→調(diào)整成分→接種→主發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清→陳釀→沙果果酒

操作要點(diǎn)：

挑選、去梗、清洗：挑選果形均勻、成熟度好、著色良好、無(wú)病蟲害及機(jī)械傷的沙果果實(shí)，剪斷果梗，挖掉果蒂，置于清水中浸泡10 min后清洗干凈。

榨汁、護(hù)色、過(guò)濾：稱取250 g洗凈的沙果，切半，置于榨汁機(jī)中榨汁。榨汁后，向汁液中添加0.5%抗壞血酸與1.0%檸檬酸的混合護(hù)色劑，防止果汁褐變。用40目紗布過(guò)濾，分離汁渣，果渣中添加50 mL蒸餾水，再次過(guò)濾，將兩次濾得的沙果果汁混合。

調(diào)整成分：測(cè)定混合后的沙果果汁的糖含量和總酸度，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)用白砂糖和檸檬酸調(diào)整發(fā)酵汁成分。

接種、發(fā)酵：按照0.2 g/L的接種量用釀酒酵母進(jìn)行接種。取少量發(fā)酵汁，添加酵母，置于40 ℃條件下活化1 h，將活化后的酵母加入發(fā)酵汁中，混勻，封閉發(fā)酵。

后發(fā)酵、澄清：將主發(fā)酵完成的果酒進(jìn)行過(guò)濾除渣，更換容器繼續(xù)密封發(fā)酵，直至酒體成熟，自然澄清即得成品。

陳釀：釀得的沙果果酒長(zhǎng)期密封保存，使得酒體酒質(zhì)澄清、風(fēng)味濃厚。

1.3.2 沙果果酒釀造單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酒精度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察發(fā)酵時(shí)間（6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）、發(fā)酵溫度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃）、初始糖度（16°Bx、18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx）和初始pH（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響，確定適宜的發(fā)酵條件范圍。

1.3.3 沙果果酒釀造正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)沙果果酒釀造單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始糖度（C）和初始pH（D）進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選沙果果酒釀造的最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)的因素與水平如表1所示。

1.3.4 測(cè)定方法

感官評(píng)定：挑選10位果酒品評(píng)經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員，根據(jù)表2沙果果酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)從色澤（20分）、氣味（30分）、滋味（40分）和形態(tài)（10分）4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分[10-12]。

理化指標(biāo)的測(cè)定：按照國(guó)標(biāo)GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》檢測(cè)沙果果酒的酒精度[13]。按國(guó)標(biāo)GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》檢測(cè)總酸和總糖[14]。

微生物指標(biāo)的測(cè)定：按國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》檢測(cè)菌落總數(shù)[15]。按國(guó)標(biāo)GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》檢測(cè)大腸菌群[16]。

表2 沙果果酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of crab apple wine

抗氧化能力分析：采用福林酚試劑法測(cè)定沙果果酒發(fā)酵過(guò)程中的總酚含量[17-18]；采用DPPH法測(cè)定沙果果酒抗氧化能力[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of crab apple wine

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，沙果果酒的酒精度不斷升高，感官評(píng)分則呈先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間為6～8 d時(shí)，酒精度上升較為迅速，在第8天時(shí)達(dá)到9.4%vol，在8 d后酒精度的上升趨勢(shì)逐漸變緩。起初，隨著酒精度的上升，感官評(píng)分也呈現(xiàn)了上升的趨勢(shì)，在12 d時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，為89.4分，隨后略微降低。沙果果酒釀造過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間不足，會(huì)造成酒精度不夠，產(chǎn)品風(fēng)味較差；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于發(fā)酵液糖度和酵母菌能力的限制，酒精度不再升高，且容易產(chǎn)生酵母菌自溶以及雜菌污染等問(wèn)題，降低果酒的品質(zhì)。因此，選取適宜的發(fā)酵時(shí)間為12 d。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of crab apple wine

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，沙果果酒的酒精度和感官評(píng)分都呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，發(fā)酵完成后的沙果果酒酒精度為10.5%vol，感官評(píng)分為83.5分，產(chǎn)品果香濃郁，但酒味稍嫌單薄，酸味稍重，原因可能是發(fā)酵溫度較低，酵母菌增殖和發(fā)酵速度較慢，少量雜菌生長(zhǎng)，利用糖類產(chǎn)生酸類物質(zhì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí)，產(chǎn)品酒精度升高至10.9%vol，酒香味增加，感官評(píng)分為87.6分，表明該溫度適于酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵，酵母菌快速繁殖和酒精度的提升抑制雜菌生長(zhǎng)，產(chǎn)品品質(zhì)較好。隨著發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，沙果果酒酒精度逐漸降低，產(chǎn)品果香、酒味減弱，逐漸產(chǎn)生酸味等異味，由此可見(jiàn)，過(guò)高的發(fā)酵溫度適于雜菌生長(zhǎng)，大量雜菌利用果汁營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)酵，產(chǎn)生小分子醛、酮、酸等物質(zhì)，抑制酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精，導(dǎo)致產(chǎn)品異味增加，酒精度降低。因此，選取適宜的發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.3 初始糖度對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響

圖3 初始糖度對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of initial sugar content on the quality of crab apple wine

由圖3可知，在發(fā)酵液初始糖度為16～22 °Bx時(shí)，隨著發(fā)酵液初始糖度的升高，發(fā)酵產(chǎn)物的酒精度也隨之提高，產(chǎn)品酒味愈加醇厚，產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分明顯升高；當(dāng)發(fā)酵液初始糖度高于22 °Bx時(shí)，產(chǎn)品酒精度升高不明顯，可能是由于過(guò)高的糖濃度抑制了酵母菌的生長(zhǎng)所致，此時(shí)感官評(píng)分略有降低；發(fā)酵液初始糖度為22°Bx時(shí)，制得沙果酒口感清爽，帶有清新的酸甜口感和濃醇的酒味，產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分為94分，酒精度為10.8%vol，品質(zhì)較好。因此，選取適宜的初始糖度為22°Bx。

2.4 初始pH對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響

pH值能夠影響發(fā)酵副產(chǎn)物從而影響釀酒酵母菌的生長(zhǎng)[21]。由圖4可知，發(fā)酵液初始pH值為3.4時(shí)，產(chǎn)品的酒精度為10.2%vol，由于pH值過(guò)低，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖受到限制，不能快速繁殖并占據(jù)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)雜菌生長(zhǎng)并利用糖類發(fā)酵，導(dǎo)致產(chǎn)品酒精度較低，產(chǎn)品酸味過(guò)重，感官評(píng)分較低。初始pH值在3.4～3.8范圍內(nèi)時(shí)，隨著pH值逐漸升高，酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)改善，產(chǎn)品的酒精度逐漸提高，pH值為3.8時(shí)，酒精度最高，為11.8%vol，隨著pH值繼續(xù)升高，產(chǎn)品酒精度有所降低。當(dāng)初始pH值為4.0時(shí)，產(chǎn)品的感官品質(zhì)最好，pH值繼續(xù)上升，產(chǎn)品的酒味減淡，酸味及其他異味增加，產(chǎn)品渾濁，感官品質(zhì)降低。因此，選取適宜的初始pH為3.8。

圖4 初始pH對(duì)沙果果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of initial pH on the quality of crab apple wine

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 沙果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of crab apple wine

由表3可知，4種因素影響沙果果酒感官品質(zhì)的主次順序依次為B＞C＞D＞A，即發(fā)酵溫度＞初始糖度＞初始pH＞發(fā)酵時(shí)間。沙果果酒的最佳釀造工藝為A2B2C2D3，即發(fā)酵時(shí)間12 d、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵液初始糖度22°Bx、初始pH4.0。由于正交試驗(yàn)中未出現(xiàn)最優(yōu)組合，故按此工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得產(chǎn)品感官評(píng)分為95.1，確定A2B2C2D3為沙果果酒釀造的最佳工藝條件。

2.6 沙果果酒的成品質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

感官指標(biāo)：色澤呈淺黃色，澄清透亮，滋味清爽，有濃郁的沙果果香和醇厚的酒香。

理化指標(biāo)：酒精度為11.8%vol，總酸含量為6.8 g/L，總糖含量為40.3 g/L。

微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)6 CFU/mL，大腸菌群＜3.0 MPN/100 mL。

均符合農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》的要求。

2.7 沙果果酒的抗氧化活性研究

分別取1 mL沙果果汁和果酒的10倍稀釋液測(cè)定多酚含量；分別取0.1 mL沙果果汁和果酒的5倍稀釋液測(cè)定DPPH自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 沙果果汁和果酒中的多酚含量及DPPH自由基清除率Fig.5 Polyphenol content and DPPH free radical scavenging rate of malusasiatica and malusasiatica wine

由圖5可知，沙果果汁和果酒中的多酚含量分別為427 μg/mL和498 μg/mL，DPPH自由基清除率分別為29.5%和52.0%。可見(jiàn)，沙果果酒中多酚含量略高于其在沙果果汁中的量，這可能是因?yàn)榻湍妇淖饔檬苟喾游镔|(zhì)進(jìn)一步浸出，同時(shí)酒精的產(chǎn)生促進(jìn)了某些多酚的溶解，可見(jiàn)沙果果酒有效保存了沙果原料中的多酚物質(zhì)。沙果果汁和果酒都有一定的DPPH自由基清除能力，且隨著多酚含量的增加，沙果果酒的DPPH自由基清除率更高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化沙果果酒的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時(shí)間12 d、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵液初始糖度22°Bx、初始pH4.0。在此優(yōu)化工藝條件下，釀得的果酒色澤呈淺黃色、澄清透亮，滋味清爽、酒體豐滿，帶酸甜口感，有濃郁的沙果果香和醇厚的酒香，酒精度為11.8%vol，感官評(píng)分為95.1分。沙果果酒可有效保存沙果中的多酚物質(zhì)，具有清除DPPH自由基能力，反映其具有較好的抗氧化活性。