老陳醋分割式濃醪酒精發酵工藝的優化

夏瑤瑤，閆裕峰，梁 楷，郎繁繁，武耀文，田 莉

（1.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030040；2.山西省食品工業研究所，山西 太原 030024）

釀醋先釀酒，酒精發酵是釀造老陳醋的關鍵工序，在整個釀造過程中起著承上啟下的作用，酒醪的品質是影響老陳醋產量及質量最為重要的因素[1-2]。就酒精發酵而言，老陳醋釀造過程中一般采用可溶性固形物含量為20%～24%發酵醪，成熟發酵醪的酒精含量為7%vol～9%vol；濃醪發酵指發酵底物糖化醪中含有30%或更高的可溶性固形物含量，成熟發酵醪的酒精度均在13%vol以上，濃醪發酵可顯著提升酒精的品質與產量，降低資源、能源的消耗，節約成本[3-4]。

濃醪酒精發酵起始于20世紀70年代，經過幾十年的研究發展，已取得了一定的研究成果。張強等[5]用玉米粉進行濃醪酒精發酵，得出糖化酶、蛋白酶、料水比、營養物質甘氨酸、脯氨酸以及肌醇均會影響酒精濃度；張欣等[6]在濃醪酒精發酵中添加木聚糖酶，有效降低了醪液黏度，提高了出酒率，縮短了發酵時間；宋璐[7]篩選出四種菌株用于濃醪酒精發酵，同時制得了活性干酵母。對濃醪酒精發酵的研究大多集中在酶、酵母菌以及添加營養物質等方面，而在濃醪酒精發酵過程進行分割式發酵，還鮮見相關研究。

在濃醪酒精發酵過程中，高底物濃度和高酒精濃度會對酵母菌的生長和發酵產生抑制作用，若為酵母菌提供充足的氮源營養，可提高酵母菌對酒精的耐受性，同時進行分割式發酵可有效克服底物濃度及酒精濃度的抑制效果[8-9]。本研究以榨油后的副產物大豆粕和花生粕為原料[10-11]，接種產蛋白酶菌種米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951，制作一種生物氮源營養劑應用于發酵，為酵母菌提供豐富的氮源；同時采用不斷取醪、補料的方法進行分割式發酵，再利用響應面法對發酵過程的糧水比、生物氮源營養劑用量及大曲用量進行優化。老陳醋分割式濃醪酒精發酵繼承了傳統的酒精發酵工藝，實現了老陳醋酒精發酵的連續性生產，不僅可提高酒醪的酒精度和原料的利用率，還能降低水耗、能耗，節約成本，增加企業的經濟效益，對提升老陳醋的產量與品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、麩皮、谷糠、稻殼、大豆粕、花生粕：市售；快曲、大曲：山西紫林醋業股份有限公司；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖：天津歐博凱化工有限公司；亞鐵氰化鉀：天津市光復精細化工研究所；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951：濟寧玉園生物科技有限公司；淀粉酶（1.5×105U/mL）：滄州夏盛酶生物技術有限公司。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ALKOMAT酒精檢測儀：德國福林斯公司；AR124CN電子天平：奧豪斯儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱、SDK-98-Ⅱ電爐：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4型水浴鍋：常州榮華儀器制造有限公司；78-1型磁力電熱攪拌器：江蘇榮華儀器制造有限公司；雷磁PHSJ-3F實驗室PH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物氮源營養劑的制備工藝流程及操作要點[12-14]

操作要點：將大豆粕與花生粕干蒸5 min，與麩皮、面粉混合，加熱水攪拌均勻，潤料20 min；潤料結束后將物料蒸煮5 min，再接種米曲霉AS3.951，接種溫度為40 ℃；將接種后的物料放入發酵池中，均勻攤開，厚度為30 cm左右，先靜置培養6 h，當溫度上升至37 ℃時通風降溫至35 ℃，培養5～6 h后進行翻料，翻料4～5 h后進行第二次翻料，再培養7～9 h后整個物料會著生孢子，生物氮源營養劑即制備完成。制備好的生物氮源營養劑應結構疏松，內部的白色菌絲茂盛，著生的淡黃綠色孢子緊密，無灰黑色夾心，水分含量應為30%～35%，蛋白酶活力＞1 000 U/g（以干基計）。

1.3.2 生物氮源營養劑制備工藝優化

稱取一定比例的大豆粕與花生粕，拌入50%的麩皮和15%的面粉，加入一定量的熱水攪拌均勻，接種米曲霉，制備生物氮源營養劑。將高粱粉碎、潤料及液化后，加快曲糖化30 min，制得糖化液。將5%生物氮源營養劑、40%大曲、0.02%酵母菌添加到糖化液中，進行酒精發酵。以發酵結束后酒醪的酒精度為考察指標，選擇大豆粕與花生粕質量比（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1）、加水量（60%、70%、80%、90%、100%）、米曲霉接種量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）為考察因素，進行單因素試驗，并在此基礎上，設計3因素3水平正交試驗，確定生物氮源營養劑制備過程的最佳工藝參數。

1.3.3 分割式濃醪酒精發酵工藝流程及操作要點[15-17]

操作要點：將高粱粉碎，加水潤料，加淀粉酶液化60～90 min，加快曲糖化30 min，得到糖化液。添加5%生物氮源營養劑、40%大曲、0.02%酵母，進行分割式濃醪酒精發酵，即發酵前3 d進行敞口發酵，第4天起密封，維持10 d的養醪發酵，然后分離30%的酒醪進入醋酸發酵階段，同時補充30%上述的糖化液，加入5%生物氮源營養劑、40%大曲，進行3 d的養醪發酵。每次酒精發酵結束后，重復進行出醪與補料，8～10輪后結束分割式濃醪酒精發酵。

1.3.4 分割式濃醪酒精發酵工藝優化

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以發酵結束后酒醪的酒精度（Y）為響應值，選擇糧水比（X1）、生物氮源營養劑用量（X2）、大曲用量（X3）為考察因素，設計3因素3水平17個試驗點的響應面分析試驗，確定分割式濃醪酒精發酵的最佳工藝參數，其因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests

1.3.5 測定方法

酒精度測定：取100 mL發酵液加100 mL蒸餾水，蒸餾出100 mL溶液，用酒精檢測儀測定酒精度；淀粉的測定：采用酸水解法[18]；總酸、還原糖、氨基酸態氮、不揮發酸、總酯、可溶性總固形物、食鹽的含量：按照國標GB/T 19777—2013《地理標志產品山西老陳醋》的方法進行測定[19]。

2 結果與分析

2.1 生物氮源營養劑制備工藝優化

2.1.1 大豆粕與花生粕最佳質量比的確定

由圖1可知，酒醪的酒精度隨大豆粕與花生粕質量比的增加呈先增加后減小的趨勢，當大豆粕與花生粕質量比為5∶1時，酒精度最高，為9.32%vol。這是由于大豆粕與花生粕質量比為5∶1時所制得的生物氮源營養劑的質量最優，可為酵母菌提供最適的氮源營養，利于酵母菌的生長及代謝，使得酒精發酵結束后酒醪的酒精度最高。因此，大豆粕與花生粕的最佳質量比為5∶1。

圖1 大豆粕與花生粕質量比對酒精度的影響Fig.1 Effect of mass ratio of soybean meal to peanut meal on alcohol content

2.1.2 最適加水量的確定

加水量的多少與所制得的生物氮源營養劑的質量密切相關。若加水量過少，米曲霉的生長代謝及酶的分泌會受到影響；但水分過高，易產生雜菌，生物氮源營養劑的質量會下降[20]。應保證潤料結束后物料的含水量為50%～55%較為適宜。由圖2可知，酒醪的酒精度隨加水量的多少先增加后減小，當加水量為80%時，酒精度最高，為9.32%vol。因此，生物氮源營養劑制備過程中的最適加水量為80%。

圖2 加水量對酒精度的影響Fig.2 Effect of water addition on alcohol content

2.1.3 米曲霉最佳接種量的確定

由圖3可知，當米曲霉接種量＜0.04%時，酒醪的酒精度隨接種量的增加而增加；接種量為0.04%時，酒精度最高，為9.64%vol；當接種量＞0.04%時，酒精度隨接種量的增加反而降低，這是由于接種量過大，米曲霉會消耗物料中的大量營養物質來進行自身的生長繁殖，使得生物氮源營養劑的質量下降，進而影響酒醪的酒精度。因此，米曲霉的最佳接種量為0.04%。

圖3 米曲霉接種量對酒精度的影響Fig.3 Effect of Aspergillus oryzae inoculum on alcohol content

2.1.4 生物氮源營養劑制備工藝優化正交試驗

以發酵結束后酒醪的酒精度為考察指標，大豆粕與花生粕質量比（A）、加水量（B）、米曲霉接種量（C）為考察因素，進行3因素3水平正交試驗，確定生物氮源營養劑制備過程的最佳工藝參數，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 生物氮源營養劑制備工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for preparation process optimization of biological nitrogen source nutrients

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2可知，3種因素對酒精度的影響順序為：大豆粕與花生粕質量比＞米曲霉接種量＞加水量。生物氮源營養劑制備過程工藝參數的最優組合為A2B2C2，即大豆粕與花生粕質量比5∶1、加水量80%、米曲霉接種量0.04%。按最佳的工藝參數進行3次驗證試驗，最終酒醪的酒精度為9.65%vol。由表3可知，該模型顯著，且大豆粕與花生粕質量比對酒精度的影響達到極顯著水平（P＜0.01），加水量與米曲霉接種量對酒精度的影響達顯著水平（P＜0.05）。

2.2 分割式濃醪酒精發酵工藝優化

2.2.1 最佳糧水比的確定

圖4 糧水比對酒精度的影響Fig.4 Effect of grain to water ratio on alcohol content

由圖4可知，酒精發酵結束后酒醪的酒精度隨糧水比在1.0∶2.0～1.0∶4.0（kg∶L）的范圍呈先增加后減小的趨勢。當糧水比為1.0∶2.0～1.0∶2.5（kg∶L）時，料液太過濃稠，流動性差且物料混合不均勻，導致液化與糖化不徹底，糖類物質無法被酵母菌充分利用，使得酒醪的酒精度很低[21]；當糧水比為1.0∶2.5（kg∶L）時，酒精度最高，為12.05%vol；當糧水比在1.0∶2.5～1∶4.0（kg∶L）時，料液變稀，糖類物質減少，酒精度降低。因此，最佳糧水比為1.0∶2.5（kg∶L）。

2.2.2 生物氮源營養劑最佳用量的確定

圖5 生物氮源營養劑用量對酒精度的影響Fig.5 Effect of biological nitrogen source nutrient addition on alcohol content

由圖5可知，當生物氮源營養劑用量為2%～4%時，酒精度隨用量的增加而增加，生物氮源營養劑用量為4%時，酒精度最高，為12.79%vol，這是由于生物氮源營養劑的使用可降低高濃度酒精對酵母菌的抑制作用，加快酵母菌的發酵速率，最終提高酒醪的酒精度[22]。但當生物氮源營養劑用量＞4%時，繼續加大營養劑的用量，酒精度反而下降，原因是若氮源濃度過高，在酒精發酵過程中會出現氮分解代謝產物阻遏狀態，從而影響細胞對氮源的吸收，不利于發酵終產物酒精的積累[23]。因此，生物氮源營養劑的最佳用量為4%。

2.2.3 大曲最佳用量的確定

圖6 大曲用量對酒精度的影響Fig.6 Effect of Daqu addition on alcohol content

大曲是老陳醋釀造過程中的糖化發酵劑，大曲的用量會影響酒精發酵結束后酒醪的酒精度。由圖6可知，當大曲用量在0～20%時，酒精度隨大曲用量的增加而增加；當大曲用量為20%時，酒醪的酒精度為12.74%vol；繼續增加大曲用量，酒精度基本不變。因此，大曲的最佳用量為20%。

2.2.4 分割式濃醪酒精發酵工藝優化響應面法試驗

以發酵結束后酒醪的酒精度（Y）為響應值，糧水比（X1）、生物氮源營養劑用量（X2）、大曲用量（X3）為考察因素，進行3因素3水平17個試驗點的響應面分析試驗，確定濃醪酒精發酵最佳工藝參數。其設計與結果見表4，方差分析見表5。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests

續表

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

用Design-Expert 8.0.6軟件對表4的結果進行分析，得到酒精度的二次多項回歸方程為Y=12.76+0.94X1+0.64X2+0.38X3+0.14X1X2+0.21X1X3-0.12X2X3-1.48X12-0.95X22-1.01X32

由表5可知，二次回歸模型的F值為287.32，P＜0.000 1，模型達到了極顯著水平。失擬項的P=0.103 6＞0.05，差異不顯著，故試驗無失擬因素存在，可反映實際的情況，所選的二次回歸模型是適合的。回歸模型的決定系數R2=0.997 3，調整決定系數R2adj=0.993 8，說明模型充分擬合試驗數據，模型成立，可用此模型對該試驗進行分析和預測。模型的變異系數為0.98%，說明試驗可靠。根據回歸方程的方差分析結果可知，模型中一次項X1、X2、X3、交互項X1X3、二次項對酒精度的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；交互項X1X2對酒精度的影響達顯著水平（P＜0.05）；交互項X2X3對酒精度沒有顯著性影響（P＞0.05）。

用Design-Expert 8.0.6軟件，根據回歸方程分析，作三維空間的曲面圖，結果見圖7。由圖7可知，三個響應面圖均有最高點，即酒精度有最大值，在固定其中兩因素的條件下，酒精度隨各因素的增加呈先增加后減小的趨勢。響應面圖的坡度陡峭表明該因素對酒精度的影響較大，坡度平緩代表該因素對酒精度的影響較小，故根據圖7可知各因素對酒精度的影響順序為：糧水比＞生物氮源營養劑用量＞大曲用量，與表5的方差分析結果一致。

圖7 糧水比、生物氮源營養劑用量、大曲用量的交互作用對酒精度影響的響應曲面與等高線Fig.7 Response surface and contour lines of the interaction between grain to water ratio,biological nitrogen source nutrient addition and Daqu addition on alcohol content

通過響應面法分析試驗得到分割式濃醪酒精發酵過程的最佳工藝參數為糧水比1.00∶2.68（kg∶L），生物氮源營養劑用量4.35%，大曲用量22.05%，在此條件下，酒醪的酒精度預測值為13.07%vol。考慮到實際操作的可行性，將上述工藝參數進行修正，即糧水比1.0∶2.7（kg∶L），生物氮源營養劑用量4%，大曲用量20%，采用修正后的參數進行3次重復試驗，得到酒精度的平均值為12.89%vol，與預測值13.07%vol相差不大。因此，利用響應面法分析試驗得到的最佳工藝參數可進行實際的酒精發酵工序操作。

2.3 分割式濃醪酒精發酵與稀醪酒精發酵的對比

傳統的稀醪酒精發酵糧水比為1.0∶4.0～4.3（kg∶L），采用1.0∶2.7（kg∶L）的分割式濃醪酒精發酵可減少潤料水及冷卻水用量，顯著降低水耗；稀醪酒精發酵的周期為16 d，大曲用量為40%，以發酵相同量的原料高梁計，采用分割式濃醪酒精發酵，發酵時間可節省16%～20%，大曲用量減少18%～24%，節約了能耗與生產成本。兩種發酵方法所制得的酒醪及半成品老陳醋的理化指標檢測結果分別見表6與表7。

表6 酒醪理化指標測定結果Table 6 Determination results of physicochemical indexes of wine mash

由表6可知，兩種酒醪的理化指標存在一定差異，采用分割式濃醪酒精發酵得到的酒醪酒精度為12.89%vol，與稀醪酒精發酵相比，酒精度提高了4.18%vol，殘還原糖可降低至0.08 g/100 mL，殘淀粉可降低至0.28 g/100 mL。

表7 老陳醋理化指標測定結果Table 7 Determination results of physicochemical indexes of aged vinegar g/100 mL

由表7可知，兩種方法所釀造的同酸度老陳醋其部分理化指標存在一定差異，分割式濃醪酒精發酵所釀造的老陳醋氨基酸態氮含量為0.25 g/100 mL，總酯含量為3.36 g/100 mL，分別較稀醪酒精發酵分別提高了25%與17%。

3 結論

本研究通過正交試驗得到分割式濃醪酒精發酵所需的生物氮源營養劑的最優制備工藝參數為：大豆粕與花生粕質量比5∶1、加水量80%、米曲霉接種量0.04%；經響應面法分析試驗得到分割式濃醪酒精發酵的最優工藝參數為糧水比1.0∶2.7（kg∶L），生物氮源營養劑用量4%，大曲用量20%，最終酒醪的酒精度為12.89%vol。與稀醪酒精發酵相比，分割式濃醪酒精發酵大曲用量節約18%～24%，發酵時間節省16%～20%；酒醪酒精度提高了4.18%vol，所釀造的老陳醋氨基酸態氮及總酯含量分別提高了25%與17%。