梁山大曲中高酯化力菌株的篩選及鑒定

顏 麗，劉秀河，李同樂

（齊魯工業大學（山東省科學院），山東 濟南 250353）

中國酒曲歷史悠久，用曲釀酒是國內白酒的特色之一，是固態發酵蒸餾酒的重要保障，其中包含大量不同的菌系及其產生的多種酶類。現代研究表明，白酒酒體中所含有的物質組成十分復雜，其中98%～99%約為乙醇水溶液，1%～2%為各種香味成分[1]。而正是這含量很低的香味成分決定了白酒品質的優劣。在眾多的香味成分中，酯類物質對白酒風味起重要作用，如濃香型白酒（五糧液）的主要香味物質是己酸乙酯、清香型白酒（汾酒）主要香味物質為乙酸乙酯和乳酸乙酯[2]。

一般而言，酯類物質產生主要有兩種途徑，一種是微生物在代謝過程中本身產生酯類物質，另一種重要途徑是在發酵過程中各種微生物產生的酯化酶將周圍環境中的有機酸和醇類催化合成酯類物質[3]。酯化酶產生菌是具有酸醇酯化能力特殊功能的特定微生物，酯化酶產生菌大多為真菌，研究表明，將酯化力高的菌種運用在白酒中，可以明顯提高白酒質量，使口感醇厚，香味濃郁。孫曉璐等[4]以中溫大曲為原料，篩選出了產酯化酶犁頭霉（Absidia orchidis），其酯化力達到9.32 g/L；周榆林等[5]從郎酒酒糟中篩選得到了1株耐酸產酯香枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZP-28；宮若楠等[6]從衡水老白干酒大曲中分離篩選得到1株高酯化力毛霉8號，最高酯化力為263.55 mg/g麩曲（以乙酸乙酯計）。但是目前，由于環境和地域差異，篩選出的菌株不利于全國性推廣使用。因此，高酯化力菌株的篩選具有重要的意義。

本研究以酯化力最高的梁山大曲為原料，酯化力為考察指標，從中篩選高酯化力菌株，并通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學試驗對其進行鑒定，為其在優質酒的領域的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

中溫大曲（1#、2#）、中高溫大曲（1#、2#）：山東梁山徐坊大曲有限公司。

蛋白胨、酵母膏、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星科技有限公司；氯霉素（純度99%）、氨芐青霉素（純度98%）：上海索寶來生物科技有限公司；制霉菌素（純度97%）、脫氧膽酸鈉（純度98%）：羅恩試劑有限公司；三丁酸甘油酯（純度95%）、乳酸石炭酸染液（純度99%）：上海阿拉丁試劑有限公司；3%聚乙烯醇（分析純）：國貿集團化學試劑有限公司；Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.2 培養基

細菌培養基[7]：牛肉膏3%，蛋白胨10%，氯化鈉5%，瓊脂20%，蒸餾水1 000 mL，三丁酸甘油酯0.4%，制霉菌素25 μg/mL，pH 7.0～7.2。

酵母培養基[8]：酵母粉10%，蛋白胨20%，葡萄糖20%，氨芐青霉素50 μg/mL，瓊脂2%，三丁酸甘油酯0.4%，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基[9]：馬鈴薯20%、蔗糖2%、瓊脂2%、三丁酸甘油酯0.4%，氯霉素25μg/mL，蒸餾水1000mL，自然pH值，脫氧膽酸鈉1mg/mL。

基礎發酵培養基：麩皮15 g，蒸餾水21 mL。

初篩培養基[10]：三丁酸甘油酯乳化液20%，蒸餾水980 mL，瓊脂20%。

3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液[11]：將3%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以體積比4∶1的比例在高速勻漿機處理9 min。

查氏酵母膏瓊脂（czapek yeast extract agar，CYA）培養基[12]：磷酸氫二鉀1‰，硝酸鈉3‰，氯化鉀0.5‰，硫酸鎂0.2‰，七水合硫酸亞鐵0.01‰，酵母提取物5‰，蔗糖3%，瓊脂1.5%，蒸餾水1 000 mL。

25%甘油硝酸鹽瓊脂（25%glycerol nitrate agar，G25N）培養基[13]：磷酸氫二鉀1‰，硝酸鈉3‰，氯化鉀0.5‰，硫酸鎂0.2‰，七水合硫酸亞鐵0.01‰，酵母提取物5‰，蔗糖3%，瓊脂1.5%，甘油25%，蒸餾水750 mL。

以上培養基滅菌條件均為121 ℃、20 min，抗生素均為滅菌后倒平板前加入。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2G無菌操作臺：蘇州凈化設備有限公司；HNY-2102C恒溫培養振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；Gzone5F抑菌圈及菌落計數測量儀：杭州訊數科技有限公司；XSP-2CA雙目顯微鏡：上海光學儀器廠；Verity 96well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：生工生物工程（上海）有限公司；牛津杯：上海申源科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲水分含量及酯化力的測定

分別取中溫大曲（1#、2#）、中高溫大曲（1#、2#）各2塊，首先，將大曲置于101～105 ℃烘干，根據烘干前后質量差，計算出水分含量。然后，參照輕工行業標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]測定其酯化力，選取酯化力高的大曲進行菌株的篩選。

1.3.2 高酯化力菌種的分離純化取曲粉2 g，加入18 mL無菌水，30 ℃、200 r/min條件下振蕩2 h，靜置30 min。吸取0.5 mL曲液到4.5 mL無菌水中進行稀釋，按10倍系列梯度稀釋至10-5，吸取200 μL稀釋度為10-3～10-5的稀釋曲液，均勻涂布于3種固體培養基（細菌培養基、酵母培養基、PDA，每種培養基做3個平行）中，細菌置于37 ℃恒溫箱中培養48 h，酵母置于28 ℃培養48 h，霉菌置于30 ℃培養箱培養5 d。從長好的平板上挑取不同的菌落于相應平板上分離后，再進行多次純化，直至平板培養基上為單菌落。

1.3.3 高酯化力菌種的篩選

（1）初篩

從平板上挑取一環生長良好的菌種（細菌和酵母）接入相應的液體培養基試管中，于相應溫度、180 r/min條件下培養24 h，即為粗酶制劑，霉菌直接制作孢子懸浮液即可。于初篩培養基中放入3～4個牛津杯，分別取粗酶制劑100 μL加入牛津杯中，于相應的溫度下培養，觀察孔周圍是否會有透明圈以及透明圈的大小，用抑菌圈測量儀測出透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），計算D/d值。選擇D/d值大的菌株進一步復篩。

（2）復篩

將初篩獲得的菌株制成孢子懸浮液（5.7×107個/mL），將孢子懸浮液以10%（V/V）接種量接入基礎發酵培養基中，30 ℃條件下培養6～7 d，于35～40 ℃的烘箱中烘干，粉碎，保存備用。取5 g菌粉，參照QB/T 5188—2017《釀造紅曲》[15]測定菌株的酯化力。

1.3.4 高酯化力菌種的鑒定

（1）形態學鑒定

菌落形態觀察：采用點種法將菌株分別接種于PDA培養基、CYA培養基和G25N培養基，30 ℃培養4 d，每天觀察菌落的顏色、形狀、菌絲情況。顯微形態觀察：在載玻片上滴加一滴生理鹽水，用接種針挑取少量菌絲置于生理鹽水中，緩慢烘干，滴加一滴乳酸石炭酸棉蘭染液，染色2 min，蓋上蓋玻片，置于光學顯微鏡下觀察菌株的菌絲結構、孢子、閉囊殼與子囊孢子的大小。

（2）生理生化鑒定

碳源同化實驗[16]：分別采用麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖替代PDA培養基中的葡萄糖，取100 μL孢子懸浮液接種于平板中，30℃條件下培養3～4d，觀察菌株的生長狀況。

氮源同化實驗[16]：分別采用牛肉膏、酵母粉、尿素、豆粉、亞硝酸鉀和硫脲替代PDA培養基中的蛋白胨，取100 μL孢子懸浮液接種于平板中，30 ℃條件下培養3～4 d，觀察菌株的生長狀況。

耐酸性實驗[17]：分別調節PDA培養基的pH值為4、5、6、7、8、9、10、11，取100 μL孢子懸浮液接種于PDA培養基中，30 ℃條件下培養3～4 d，觀察菌株生長狀況。

耐乙醇實驗[18]：在PDA培養基中分別加入3%、6%、9%、12%、15%、18%的無水乙醇，取100μL孢子懸浮液接種于PDA培養基中，30 ℃條件下培養3～4 d，觀察菌株生長狀況。

（3）分子生物學鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的DNA，以其為模板，采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系：模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5mmol/L）1.0μL，DNA聚合酶0.2μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物有限公司測序，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS序列，利用MEGA7軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹[19-20]。

2 結果與分析

2.1 大曲酯化力和含水量測定結果

中溫、中高溫大曲的含水量及酯化力測定結果見表1。

表1 大曲酯化力和含水量測定結果Table 1 Determination results of esterification power and moisture of Daqu

由表1可知，中溫大曲2#的含水量（12.30±0.23）%及酯化力（712.8±0.68）U均最高，因此，選擇中溫大曲2#為目標大曲。

2.2 大曲中高酯化力菌株的篩選

2.2.1 初篩

通過分離純化后，從中溫大曲2#中初步分離出3株細菌（X1～X3）、1株酵母（J1）、6株霉菌（Z1～Z6）。以三丁酸甘油酯為底物對菌株進行初篩，結果見表2。

表2 高酯化力菌株初篩結果Table 2 Preliminary screening results of strain with high esterification power

續表

由表2可知，10株菌株的D/d值為1.555～2.686，均具有水解三丁酸甘油酯的能力，其中，霉菌的D/d值最大，選取其中D/d值較大的5株霉菌（Z1、Z2、Z3、Z4、Z6）進行復篩。

2.2.2 復篩

菌株Z1、Z2、Z3、Z4、Z6的酯化力測定結果見表3。

表3 高酯化力菌株復篩結果Table 3 Secondary screening results of strain with high esterification power

由表3可知，菌株Z1的酯化力最高為66.943 mg/g·100 h，且高于QB/T 5188—2017《釀造紅曲》規定的30 mg/g·100 h。因此，選定該菌株為目標菌株進行菌種鑒定，并編號為YL-1。

2.3 菌株YL-1的鑒定

2.3.1 形態學鑒定

（1）個體形態觀察

菌株YL-1在PDA培養基、CYA培養基和G25N培養基上的菌落及菌絲形態見表4。

表4 菌株YL-1的菌落形態特征Table 4 Colony morphological characteristics of strain YL-1

由表4可知，菌株YL-1在培養基上生長旺盛，菌絲濃密呈現白色；菌落平坦，呈圓形，直徑可達到5 cm，在PDA培養基表面和背面呈現橙黃色，CYA培養基表面和背面呈橙紅色，G25N培養基表面呈白色。菌株的菌絲有橫隔、分枝，內含有多核，孢子主要生長在菌絲的頂端，閉囊殼呈球形，且閉囊殼內還有許多子囊，子囊也呈現為球形。結合《菌種鑒定手冊》[21]初步判斷該菌株為紅曲霉（Monascus）。

2.3.2 生理生化鑒定

（1）碳氮源同化實驗結果

菌株YL-1的碳氮源同化實驗結果見表5。由表5可知，菌株YL-1可利用果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖，且對麥芽糖和葡萄糖的利用效果最好。菌株YL-1可利用牛肉膏、酵母粉、豆粉等有機氮源以及尿素，但不能利用硫脲、亞硝酸鉀等無機氮源。

表5 菌株YL-1碳氮源同化實驗結果Table 5 Results of carbon and nitrogen source assimilation experiments of strain YL-1

（2）耐酸性實驗結果

菌株YL-1的耐酸性實驗結果見表6。由表6可知，菌株YL-1具有一定的耐酸能力，在pH為4時生長狀況良好，這與紅曲霉嗜酸性一致[22]，可判定該菌株為紅曲霉（Monascus）。

表6 菌株YL-1耐酸性實驗結果Table 6 Results of acid tolerance experiments of strain YL-1

（3）耐乙醇實驗結果

菌株YL-1的耐乙醇實驗結果見表7。由表7可知，菌株YL-1耐乙醇能力非常高，可在15%的乙醇含量下生長。

表7 菌株YL-1耐乙醇實驗結果Table 7 Results of ethanol tolerance experiments of strain YL-1

2.3.3 分子生物學鑒定

菌株YL-1的系統發育樹見圖1。

圖1 基于ITS基因序列菌株YL-1的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain YL-1 based on ITS gene sequences

由圖1可知，菌株YL-1與叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）CBS 286.34（MH855520.1）及紅色紅曲霉（Monascus ruber）CGMCC 3.4701（MK359688.1）聚于一支，親緣關系最近，結合形態學鑒定與生理生化鑒定，鑒定該菌株為叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）。

3 結論

本實驗以梁山中溫大曲為原料，篩選得到一株酯化力高的菌株YL-1，酯化力為66.94 mg/g·100 h，遠高于輕工行業標準QB/T 5188—2017《釀造紅曲》中規定的酯化力（30 mg/g·100 h）。通過形態學觀察、生理生化實驗及分子生物學鑒定，確定該菌株為叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）。