常壓室溫等離子體誘變選育高產(chǎn)酸植物乳桿菌

殷 娜，嚴(yán)小玉，馬 珊，張劍林，徐 敏，王犁燁，程方方，武亞婷，劉維兵，武 運

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052：3.新疆維吾爾自治區(qū)科技項目服務(wù)中心，新疆 烏魯木齊 830052；4.烏魯木齊市奶業(yè)協(xié)會，新疆 烏魯木齊 830000）

乳酸菌是一類能利用發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏染色陽性、無芽孢的細(xì)菌的總稱，在自然界中分布廣泛[1-2]，是人類生活中應(yīng)用較早的一類微生物，可以起到提高食品風(fēng)味和改善食品品質(zhì)的作用[3]。優(yōu)良的乳酸菌應(yīng)該具有良好的發(fā)酵性和較強(qiáng)的耐受性，從而通過發(fā)酵可提高和改善各類乳酸菌發(fā)酵食品的營養(yǎng)物質(zhì)含量以及風(fēng)味[4]。由于各種不良環(huán)境的脅迫及不利因素的影響，嚴(yán)重地抑制了乳酸菌的生長代謝能力，進(jìn)而影響了其益生功能的發(fā)揮及高效活性的利用[5]。目前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)酸乳酸菌菌株，幾乎都是通過誘變育種來提高其生產(chǎn)性能，并且誘變育種具有變異范圍廣泛，類型多樣等優(yōu)良特點，所以誘變是目前使用較廣泛的一種育種手段[6]。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plas ma，ARTP）是常壓非平衡放電等離子體的一種[7]。常壓室溫等離子體誘變與傳統(tǒng)的誘變方法相比較，其設(shè)備更精良，操作方法更簡易，安全系數(shù)更高，突變頻率高，更重要的是對環(huán)境沒有污染[8]。ARTP所激發(fā)出的活性粒子能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)都具有一定的影響，并通過對遺傳物質(zhì)損傷機(jī)制的多樣性，獲得多樣的突變體[9-10]，在多種微生物如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、米曲霉菌（Aspergillus oryzae）和酵母菌種選育中得到成功運用[11-15]。目前在國內(nèi)已有使用其他誘變方法如重離子束輻照法誘變選育高產(chǎn)酸乳酸菌的研究[16]，且目前利用ARTP誘變選育植物乳桿菌細(xì)菌素高產(chǎn)菌株的研究較多[17-19]，但鮮有利用ARTP誘變選育高產(chǎn)酸乳酸菌的報道。

在新疆地區(qū)發(fā)酵酸乳制品種類多樣，以至于優(yōu)質(zhì)乳酸菌種類多樣，地區(qū)優(yōu)勢明顯，更是發(fā)展發(fā)酵酸乳制品的理想產(chǎn)區(qū)[20]。本試驗通過前期從新疆烏魯木齊農(nóng)牧民家中采集的酸馬乳中分離篩選得到的一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15，以其為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子（ARTP）誘變的方式提高植物乳桿菌YL15產(chǎn)酸量，從而來提高后期研究中驢乳發(fā)酵制品的品質(zhì)，同時為植物乳桿菌的廣泛應(yīng)用提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院食品生物發(fā)酵與質(zhì)量安全研究室。

1.1.2 化學(xué)試劑

無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；酚酞（分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司；篩選培養(yǎng)基（含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基）：在MRS培養(yǎng)基中加入3%的碳酸鈣。

1.2 儀器與設(shè)備

ⅡS常壓室溫等離子誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；FA2014N分析天平：北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HR40-A2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；MJX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PTX-FA210電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；SNB-1數(shù)字黏度計：上海天美天平儀器有限公司；FE28 Plus pH計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20 PLUS pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化和菌懸液的制備

首先將保存于冰箱的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15接種于MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下放置培養(yǎng)24 h；然后以2%的接種量接入MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下放置培養(yǎng)24 h后，接種到MRS固體培養(yǎng)基中。挑選出單菌落接種到MRS 固體培養(yǎng)基斜面上，并放置在37 ℃條件下培養(yǎng)，在冰箱中保存；最后將斜面上的初始菌接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，重復(fù)兩次制備菌懸液。

1.3.2 菌株YL15生長曲線的測定

將在MRS肉湯液體培養(yǎng)基中活化好的YL15菌液以4%的接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)，每間隔2 h取一次樣，在波長600 nm處測定吸光度值，以空白培養(yǎng)基為對照，根據(jù)測得的吸光度值繪制菌株YL15的生長曲線，確定菌株YL15的生長對數(shù)期。

1.3.3 ARTP誘變試驗

試驗前期的準(zhǔn)備工作：首先用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇對操作臺內(nèi)部進(jìn)行擦拭，然后將紫外燈打開殺菌15～30 min。試驗參數(shù)：工作氣體選擇純度為99.999%的氦氣（He），氣流量調(diào)至10 L/min，電源功率設(shè)為120 W，操作溫度為20 ℃，發(fā)射源與菌懸液的工作距離為2 mm，試驗處理時間為0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s。

誘變試驗：在無菌條件下吸取1 mL在MRS肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期的初始菌株YL15的菌液，在3 000 r/min條件下離心10 min，去掉上清液，吸取10 μL放在載片上，將載片分別放在凹槽中，并將吸有1 mL MRS肉湯的EP管放在下方，便可進(jìn)行試驗，經(jīng)過誘變處理后利用旋渦混合器將裝有載片的EP管劇烈振蕩1 min，將載片上的誘變菌全部洗下，梯度稀釋10-6～10-8后，取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下避光培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計菌落數(shù)，得到致死率，確定最佳誘變時間。致死率計算公式如下：

式中：Z為菌株的致死率，%；X1為ARTP誘變后的菌落數(shù)，CFU；X為對照組的菌落數(shù)，CFU。

1.3.4 高產(chǎn)酸乳酸菌初篩

從培養(yǎng)48 h的誘變菌株中挑單菌落點接到篩選培養(yǎng)基上，再點接初始菌株YL15作為對照，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后，觀察誘變菌株的溶鈣圈直徑，乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)和CaCO3反應(yīng)而出現(xiàn)溶解圈。測量誘變菌株的溶鈣圈直徑（H）并對誘變菌株的菌落直徑（C）進(jìn)行測定，計算HC值，即菌株溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值，挑選其中HC值相比于原始HC值大30%的菌株保存，進(jìn)行下一步復(fù)發(fā)酵篩選。

1.3.5 高產(chǎn)酸乳酸菌的復(fù)篩

復(fù)篩的過程是將初篩得到的產(chǎn)酸能力較高的誘變菌株進(jìn)行活化，并接種到100 mL MRS 肉湯中在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，通過酸度的測定選取發(fā)酵酸度較高的菌株為高產(chǎn)酸菌株，挑選其中產(chǎn)酸量較高的正突變菌株進(jìn)行保存[21]。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性試驗

將突變?nèi)樗峋赀B續(xù)傳代培養(yǎng)5次，測定每一代突變菌株的產(chǎn)酸能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.3.7 高產(chǎn)酸乳酸菌最適生長條件的研究

將突變菌株在不同溫度與pH條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在波長600 nm處測定吸光度值，從而確定其最適生長溫度與pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌YL15生長曲線

圖1 菌株YL15生長曲線Fig.1 Growth curve of strain YL15

菌株YL15的生長曲線見圖1。由圖1可知，將菌株YL15接入MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，前0～6 h菌株YL15生長處于延滯期，增長相對緩慢，OD600nm值變化波動很小；在6～14 h菌株YL15增長迅速，OD600nm值迅速增加，此時菌株YL15處于對數(shù)生長期；在18～27 h后植物乳桿菌步入穩(wěn)定期，27 h后逐漸進(jìn)入衰亡。在一定程度上乳酸菌菌株在不同生理狀態(tài)下對誘變的敏感程度不同，當(dāng)乳酸菌菌株生長到對數(shù)期時，其繁殖力強(qiáng)，生長速度迅猛，且菌種數(shù)量以一個穩(wěn)定的速率增長，對環(huán)境因素的影響更為敏感。在對數(shù)期進(jìn)行誘變，可以提高基因突變率和穩(wěn)定遺傳性[22]。因此，本試驗對處于對數(shù)生長期10 h時的菌株YL15進(jìn)行誘變試驗。

2.2 最佳誘變時間的確定

圖2 不同處理時間對菌株YL15致死率的影響Fig.2 Effect of different treatment time on lethally rate of strain YL15

取菌株YL15懸液，按照1.3.3節(jié)誘變條件下進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變處理，然后分別將經(jīng)過0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s不同處理時間后的突變株數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，計算致死率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，經(jīng)過統(tǒng)計得到隨著處理時間的遞增，致死率越來越高，說明乳酸菌對ARTP誘變非常敏感，處理時間為100 s時，致死率達(dá)到91.09%；處理時間為120 s時，菌株無存活。當(dāng)致死率＞90%時，菌株突變產(chǎn)生高產(chǎn)突變的概率相對較高，且菌株在此突變率下恢復(fù)突變的概率更小[23]。因此，考慮到乳酸菌的敏感性及ARTP誘變的穩(wěn)定性，最終將本試驗ARTP 誘變的處理時間確定為100 s。

2.3 誘變菌株初篩結(jié)果

挑選單菌落點接到含碳酸鈣的MRS 固體培養(yǎng)基上，再點接初始菌株YL15作為對照，測定菌株溶鈣圈直徑與菌落直徑，計算HC值，結(jié)果見表1。

表1 誘變菌株的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of mutagenic strains

由表1可知，初始菌株YL15的平均HC值為2.915，通過初篩篩出HC值超出初始菌株YL15 HC值30%的菌株6株，分別為YL15-3、YL15-4、YL15-6、YL15-21、YL15-30和YL15-31，其HC 值范圍在3.824～3.962之間。因此，對初篩出的6株菌株進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)篩。

2.4 誘變菌株復(fù)篩結(jié)果

圖3 誘變菌株復(fù)篩結(jié)果Fig.3 Secondary screening results of mutagenic strains

測定6株菌株的酸度，其產(chǎn)酸情況見圖3。由圖3可知，初始菌株YL15的產(chǎn)酸量為10×10-3mol/L，誘變菌株YL15-3：15.4×10-3mol/L、YL15-4：17×10-3mol/L、YL15-6：15×10-3mol/L、YL15-21：16×10-3mol/L、YL15-30：14×10-3mol/L和YL15-31：14.7×10-3mol/L，與初始菌株YL15相比，突變菌株的產(chǎn)酸能力明顯提高，與初篩結(jié)果相符。6株突變菌株產(chǎn)酸順序由大到小依次為：菌株YL15-4＞菌株YL15-21＞菌株YL15-3＞菌株YL15-31＞菌株YL15-30＞菌株YL15-6。王璐等[24]在自然發(fā)酵蘋果原漿樣品中分離篩選出的植物乳桿菌S3-1024h時的產(chǎn)酸量為10×10-3mol/L，與植物乳桿菌S3-10相比，誘變后的6株菌株的產(chǎn)酸量明顯高于菌株S3-10。通過ARTP誘變能夠改變菌株的某些基因，從而改變菌株的某些特性。因此，最終將突變菌株YL15-4確定為目標(biāo)菌株。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

圖4 菌株YL15-4連續(xù)5代產(chǎn)酸情況Fig.4 Acid production of strain YL15-4 for 5 successive generations

將突變菌株YL15-4培養(yǎng)5代，測定每一代菌液的產(chǎn)酸量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，第二代菌株最高產(chǎn)酸量為17×10-3mol/L，第三代菌株最高產(chǎn)酸量為15×10-3mol/L。雖然5代菌株的產(chǎn)酸能力存在微小差距，但是平均產(chǎn)酸量都維持在16.1×10-3mol/L左右。由此可以表明，突變菌株YL15-4的高產(chǎn)酸性能可以穩(wěn)定的遺傳。

2.6 誘變菌株的最適生長條件

2.6.1 最適生長溫度

圖5 菌株YL15-4的最適生長溫度Fig.5 Optimal growth temperature of strain YL15-4

在微生物生長繁殖過程中溫度對其影響較大，因此為了充分利用該菌株，對菌株YL15-4最適生長溫度進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著溫度在30～37 ℃范圍內(nèi)的升高，OD600nm值呈上升趨勢，溫度在37 ℃時，OD600nm值最大為2.1，溫度在37～45 ℃范圍的升高，OD600nm值呈下降趨勢。因此，菌株YL15-4最適生長溫度為37 ℃。

2.6.2 最適生長pH值

圖6 菌株YL15-1的最適生長pH值Fig.6 Optimal growth pH of strain YL15-1

pH值過高或過低都會嚴(yán)重影響菌株的生長，對菌株YL15-4最適生長pH值進(jìn)行測定，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在pH值為4.0～5.0范圍內(nèi)，菌株生長較為迅速，pH值＞5.0之后，OD600nm值有所下降。因此，菌株YL15-4最適生長pH值為5.0。

3 結(jié)論

本研究通過以新疆烏魯木齊農(nóng)牧民家中采集的酸馬乳中分離篩選出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15，在確定工作氣流量、電源功率、操作溫度以及等離子體發(fā)射源與菌懸液的距離后，經(jīng)單因素試驗確定在最佳誘變處理條件為120 W照射100 s。利用篩選培養(yǎng)基及pH測定試驗對照射后挑選的33株突變菌株進(jìn)行初篩，最后再通過產(chǎn)酸能力測定試驗確定目標(biāo)菌株為YL15-4，其產(chǎn)酸量為15×10-3mol/L，高于初始菌株的YL15產(chǎn)酸量的50%。突變菌株YL15-4遺傳性能穩(wěn)定，最適生長溫度為37 ℃，最適生長pH值為5.0。植物乳桿菌在發(fā)酵制品、開發(fā)功能益生產(chǎn)品方面有更廣闊的應(yīng)用前景。