纖維素降解芽孢菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

毛 婷，朱瑞清，牛永艷，杜津昊，鄭 群，王治業(yè)

（甘肅省科學院生物研究所 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

纖維素是由D-葡萄糖苷以β-葡萄糖苷鍵結合成的高分子化合物，是地球上含量最豐富、分布最廣泛、永不枯竭的可再生資源。利用現(xiàn)代生物技術，采用纖維素酶將纖維素轉化為小分子有機物，可以有效解決世界能源、糧食短缺，環(huán)境污染等問題[1]。纖維素酶是一類復合酶系的總稱，自1906年首次被研發(fā)，其降解纖維素機理主要有原初反應假說、碎片理論、順序作用假說和協(xié)同理論等。目前，協(xié)同理論被普遍公認，其作用機制為纖維素內切酶作用于纖維素非結晶區(qū)水解β-1,4葡萄糖苷鍵，將纖維素長鏈切割為不同聚合度的短鏈纖維素；纖維素外切酶作用于短鏈纖維素非還原端依次裂解β-1,4葡萄糖苷鍵釋放纖維二糖分子；β-葡萄苷酶將纖維二糖及其他低分子纖維糊精水解為葡萄糖[2]，纖維素的降解需要至少這三種酶的協(xié)同作用。

我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈的年產(chǎn)量高達6億t，秸稈作為農(nóng)作物提取出果實后的剩余物，是一類極重要的可再生資源，但目前秸稈被直接焚燒，填埋并沒有得到有效的利用。利用纖維素酶對秸稈中纖維素類物質進行降解是最快速、經(jīng)濟、環(huán)保、有效的途徑。產(chǎn)纖維素酶菌株主要有細菌和真菌[3]。目前工業(yè)使用的酸性纖維素酶生產(chǎn)菌主要來自里氏木霉（Trichoderma reesel）、黑曲霉（Aspergillus niger）等，中性及堿性纖維素酶生產(chǎn)菌主要來自芽孢桿菌等，中性及偏堿性纖維素酶，在紡織、造紙行業(yè)應用廣泛[4]。真菌產(chǎn)纖維素酶酶系協(xié)調，酶活性高，但多數(shù)真菌好氧的特性，對環(huán)境要求嚴格，導致在一些纖維類廢物的處理及飼料發(fā)酵工藝應用受限。

芽孢桿菌產(chǎn)生纖維素酶系中內切纖維素酶活性相對其他菌株較高，可以在不利的條件下形成芽孢，適應高溫、酸堿性較強的環(huán)境，培養(yǎng)周期短、代謝產(chǎn)物豐厚，在發(fā)酵工業(yè)具有重大的應用前景[5]。目前，許多學者嘗試從自然界中的土壤、水體、腐殖質及生物體內等環(huán)境中分離篩選產(chǎn)纖維素酶芽孢菌，并取得了一定的成績[6]。梁倩等[7]從黑龍江玉米地土壤中篩選出高產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株產(chǎn)纖維素酶具有耐熱、耐鹽、耐酸并可被Cu2+激活。AHMAD R等[8]利用剛果紅平板染色法從牛瘤胃中分離出一株芽孢桿菌BD92，該菌株羧甲基纖維素酶活為240 U/L。MUHAMAD A等[9]從白蟻腸道分離出一株產(chǎn)纖維素酶菌株，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），該菌株羧甲基纖維素酶活最高可達到1 156 U/L。SUN L H等[10]從鵝盲腸中分離得到一株具有纖維素酶分泌和益生菌特性的液化淀粉芽孢桿菌，濾紙纖維素酶活達到1.25 U/mL。目前報道的所選育出的芽孢桿菌菌株酶活性低，高效產(chǎn)酶的菌種較少，因此，仍然需要尋找新的高產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌菌株。

纖維素酶菌株來源主要通過自然選育、誘變育種、抗降解物阻礙突變株篩選、原生質融合、基因工程育種等方法。其中自然選育是最簡單也是最基本的纖維素酶產(chǎn)生菌獲得方式[11]。本試驗通過自然選育從原始森林公園興隆山腐木中篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，并對其進行種屬鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化，豐富產(chǎn)纖維素酶菌株的微生物來源，為纖維素酶制劑的研制或基因工程菌株的構建提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

本試驗采用原始森林公園興隆山中腐木樣品。采集時去除表面雜質，裝入自封袋中并編號，取樣時在超凈工作臺中將腐木樣用滅菌的刀片剖開，于中心位置取樣品，塊狀、余樣4 ℃保存。

1.1.2 試劑

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）：天津市大茂化學試劑廠；新華定量濾紙：杭州沃華濾紙有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海中泰化學試劑有限公司；麩皮：濟南鴻恩化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[12]：CMC-Na 1 g，酵母粉1 g，KH2PO40.1 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，H2O 100 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

剛果紅纖維素分離培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g，（NH4）2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂2 g，H2O 100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，牛肉膏1 g，酵母粉0.5 g，葡萄糖0.5 g，NaCl 0.5 g，H2O 100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：麩皮5 g，蛋白胨0.3 g，（NH4）2SO40.3 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.5 g，H2O 100 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

濾紙條崩解培養(yǎng)基[14]：KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，（NH4）2SO40.3g，酵母粉0.01g，H2O100mL，121℃滅菌20min。

營養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g，牛肉膏10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

AS型干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；LBH-300T多功能粉碎機：永康科徠爾有限公司；SKY-100C恒溫搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；UV-120-02紫外可見分光光度計：日本島津公司；MJ-150Ⅱ培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；ZRN-PH-D型臺式pH計：北京中瑞能儀表技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 纖維素降解菌的篩選

將腐木樣品5 g裝入裝有玻璃珠的45 mL無菌水中，振蕩30 min混勻。取1 mL菌懸液接入20 mL富集培養(yǎng)基中，在35 ℃、200 r/min恒溫振蕩器中富集培養(yǎng)48 h。將富集培養(yǎng)后的腐木混合菌液進行10倍稀釋，各吸取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6的菌液100 μL涂于剛果紅篩選培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行，倒置放入35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生透明圈。挑取剛果紅平板上有明顯透明圈的菌株。根據(jù)測量培養(yǎng)基中菌落的透明圈直徑（D，cm）與菌落直徑（d，cm），計算二者的比值（D/d），選取比值較大的菌株劃線純化4～5代后測定纖維素酶活力并保存[15]。

將初篩得到的菌株接種至20 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，制成種子液。將種子液以3%接種量接入200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測定酶活。纖維素酶活的測定采用DNS法，酶活性單位定義為在50 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘從底物溶液中分解產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量為1個酶活性單位（U）。

濾紙酶活測定方法[16]：在25 mL刻度具塞試管中加入磷酸緩沖液（pH 6.0）1 mL、1 cm×6 cm的新華濾紙條1條，準確加入稀釋好的待測酶液0.5 mL，50 ℃水浴30 min，加入2.0 mL DNS試劑，具塞沸水浴5 min，立即冷卻，終止反應后定容至25 mL，搖勻后在波長550 nm處測定吸光度值，每管重復3次取平均值，通過葡萄糖標準曲線回歸方程求出還原糖的含量。

葡萄糖標準曲線的制定：無水葡萄糖（105 ℃烘干至質量恒定）配制成質量濃度1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別取此標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于比色管中，補水至2 mL，加入2.0 mL DNS試劑，具塞沸水浴5 min，立即冷卻，終止反應后定容至25 mL，搖勻后在波長550 nm處測定吸光度值。以吸光度值作為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標制作葡萄糖標準曲線并建立回歸方程。

濾紙崩解試驗：將測定纖維素酶活后篩選得到的菌株接種到種子培養(yǎng)基中制成菌懸液，取5 mL加入100 mL濾紙條崩解培養(yǎng)基中，每個三角瓶中放1/4Φ12.5 cm的扇形濾紙，30 ℃、100 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，以未加菌株的試驗為對照，觀察濾紙條崩解情況。

1.3.2 菌株的鑒定

將復篩出的產(chǎn)纖維素酶菌株涂布于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，觀察單菌落的隆起形狀、形態(tài)、透明度、質地、顏色、邊緣等。菌株的生理生化特描述參照及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行[17]。

利用微生物16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株16S rDNA序列進行擴增。菌落聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化回收后送至上海生物技術有限公司測序，利用BLAST軟件將測序結果與GenBank中已有序列進行比對，使用MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

分析菌株在液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)纖維素酶的影響因素。在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上，考察培養(yǎng)時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、培養(yǎng)溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃）、初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、裝液量（10%、20%、30%、40%、50%）這5個單因素對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。

在單因素優(yōu)化的基礎上，以濾紙酶活（Y）為評價指標，分別選取培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）、接種量（C）及裝液量（D）為考察因素設計正交試驗，采取L9（34）正交試驗設計，優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 纖維素酶生產(chǎn)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cellulase production conditions optimization

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 菌株初篩

通過樣品的富集及剛果紅平板染色法初篩，在平板中篩選有明顯透明圈的菌株分離純化，得到2株D/d較高菌株，分別命名為K1、K2。D/d比值大小，可以反映出纖維素酶活力高低，比值越大，說明纖維素降解能力越強。將菌株K1、K2點種于剛果紅平板上培養(yǎng)，菌落周圍有很大的透明圈，說明該菌株具有分解羧甲基纖維素能力，如圖1所示。

圖1 菌株K1、K2在剛果紅平板上的透明圈Fig.1 Transparent circle of strains K1 and K2 on Congo red plate

2.1.2 菌株復篩

將菌株K1、K2接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，收集粗酶液，適當稀釋后檢測羧甲基纖維素酶大小進一步篩選。以吸光度值（Y）作為縱坐標，葡萄糖含量（X）為橫坐標制作標準曲線，回歸方程為Y=0.533 4X-0.008 9，相關系數(shù)R2為0.998 2，表明標準曲線線性關系良好。菌株K1、K2 D/d值和濾紙纖維素酶活測定結果見表2。由表2可知，菌株K1、K2的D/d比值分別為2.5、2.4，濾紙酶活分別為45.3U/mL、43.6U/mL，兩菌株酶活數(shù)據(jù)相差不明顯，可通過濾紙崩解試驗進一步分析判斷。

表2 菌株復篩結果Table 2 Secondary screening results of strains

將菌株K1、K2接入濾紙條崩解培養(yǎng)基中，每天觀察培養(yǎng)基中濾紙形態(tài)。第1天，菌株K1、K2的濾紙邊緣出現(xiàn)不同程度的分解；第2天，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，濾紙分解程度明顯高于第1天；第3天，菌株K1中濾紙被分解為紙屑且培養(yǎng)基顏色渾濁更明顯，菌株K2中仍能看見未被分解完全的濾紙，而不添加菌株的空白組濾紙仍存在，呈扇形狀。說明分離篩選出的菌株K1、K2具有明顯的纖維素降解能力，且從濾紙分解情況初步可以判斷，菌株K1濾紙分解能力高于菌株K2。

2.2 菌株的形態(tài)學觀察及生理生化特征

菌株K1、K2的革蘭氏染色及形態(tài)學觀察見圖2。由圖2可知，菌株K1呈乳黃色，邊緣整齊、無皺褶；菌株K2呈灰白色，菌落較大，表面粗糙不規(guī)則，隆起、皺褶。菌株K1、K2均為革蘭氏陽性菌。

菌株K1、K2生理生化特征如表3所示。由表3可知，菌株K1好氧，芽孢染色、接觸酶、氧化酶、V-P試驗均為陽性，甲基紅、吲哚、硫化氫試驗為陰性，菌株可利用葡萄糖、果糖、淀粉及羧甲基纖維素鈉；菌株K2生理生化特征同菌株K1，因此初步判定兩株菌均為芽孢桿菌或其變種。

圖2 菌株K1、K2的革蘭氏染色及形態(tài)學觀察結果Fig.2 Results of Gram staining and morphological observation of strains K1 and K2

表3 菌株K1、K2的生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristic of strains K1 and K2

2.3 16S rDNA測序與分析

篩選到的兩株菌使用細菌16SrDNA通用引物做PCR，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測在1 500 bp左右，如圖3所示。

圖3 菌株K1、K2瓊脂凝膠電泳圖Fig.3 Agar gel electrophoresis of strains K1 and K2

將PCR產(chǎn)物送至生工（上海）生物工程有限公司進行測序，測序結果在美國生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）Blast上比對，結果表明菌株K1與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）相似度99%以上，菌株K2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）相似度在99%以上。根據(jù)K1、K2在NCBI Blast上比對的結果，在芽孢桿菌屬選取13株菌株使用MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。因此，菌株K1被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），菌株K2被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。

圖4 基于16S rDNA基因序列菌株K1、K2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogentic tree of strains K1 and K2 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化[18-19]

2.4.1 單因素優(yōu)化

（1）培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響

圖5 培養(yǎng)時間對菌株K1和K2產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of culture time on enzyme production by strains K1 and K2

從圖5可以看出，在發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵時間的延長，濾紙酶活逐漸升高；之后隨著發(fā)酵時間的延長，濾紙酶活基本穩(wěn)定不再升高；發(fā)酵后期隨著時間的延長，濾紙酶活有所降低。菌株K1在3 d時濾紙酶活達到72.2 U/mL，而菌株K2在2 d時濾紙酶活達到62.3 U/mL，菌株K2相對于菌株K1較早達到酶活高峰時間。因此，選擇菌株K1的培養(yǎng)時間為3 d，菌株K2的培養(yǎng)時間為2 d。

（2）培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

圖6 培養(yǎng)溫度對菌株K1和K2產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of culture temperature on enzyme production by strains K1 and K2

從圖6可以看出，當培養(yǎng)溫度低于32 ℃時，隨著溫度的升高濾紙酶活升高；在34 ℃時菌株K1、K2濾紙酶活分別為80.3 U/mL、74.0 U/mL；溫度超過37 ℃之后，隨著溫度的升高濾紙酶活明顯減低。芽孢桿菌的最適生長溫度為30～37 ℃，在體外不適應的環(huán)境下可以形成芽孢，抵抗力及環(huán)境適應性強，而不同溫度條件下，微生物代謝途徑不同，溫度對菌株的生長和代謝產(chǎn)物的積累存在一定的影響。因此選擇菌株K1、K2的培養(yǎng)溫度為34 ℃。

（3）初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

圖7 初始pH對菌株K1和K2產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on enzyme production by strains K1 and K2

從圖7可以看出，初始pH值為7.0時，菌株K1、K2濾紙酶活最高，在pH＜6.0的酸性條件及pH＞7.0的堿性條件下，濾紙酶活較低。pH值是菌株生長的重要環(huán)境因子，影響菌種營養(yǎng)物質的吸收和代謝過程中酶的活性[20]。大部分的細菌適合中性環(huán)境中生長，而霉菌和酵母菌適宜在pH＜5.0的酸性環(huán)境中生長。因此，選擇菌株K1、K2最適初始pH為7.0。

（4）接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

圖8 接種量對菌株K1和K2產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of inoculum on enzyme production by strains K1 and K2

從圖8可以看出，接種量＞6%之后，發(fā)酵液中溶解氧含量偏低，對于好氧菌的生長定會產(chǎn)生抑制作用；接種量＜6%之后，會延長菌體達到高峰時間，影響產(chǎn)物的合成。不同微生物生長最適接種量不同，細菌的接種量一般控制在1%～5%。因此，選擇菌株K1、K2最適接種量為6%。

（5）裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響

圖9 裝液量對菌株K1和K2產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of loading liquid on enzyme production by strains K1 and K2

從圖9可以看出，裝液量在10%～30%時，隨著裝液量的增加，菌株酶活性逐步提高。在裝液量為30%時，菌株K1、K2酶活性達到最高分別為94.0 U/mL、86.7 U/mL。因次，選擇菌株K1、K2最適裝液量為30%。

2.4.2 正交試驗優(yōu)化菌株K1產(chǎn)酶條件

根據(jù)單因素優(yōu)化結果，菌株K1、K2濾紙酶活在目前報道的關于芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶菌株中酶活處于較高水平，菌株K1濾紙酶活高于菌株K2。因此，以菌株K1為目標菌株，以濾紙酶活為評價指標，選取培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）、接種量（C）、裝液量（D）為考察因素，正交試驗結果如表4所示。由表4可知，4個因素對濾紙酶活的影響依次為培養(yǎng)溫度＞初始pH值＞接種量＞裝液量。根據(jù)極差獲得的最優(yōu)產(chǎn)酶組合條件為A2B2C1D3。

通過極差分析獲得的最優(yōu)組合條件A2B2C1D3未出現(xiàn)在正交表中，需要與正交表中最高組合A2B2C3D1比較。在最優(yōu)組合條件即培養(yǎng)溫度34 ℃、pH 7.0、接種量5%、裝液量40%，K1濾紙酶活為98.4 U/mL。通過極差分析得到的組合A2B2C1D3產(chǎn)生的濾紙酶活略高于正交試驗得到的最優(yōu)組合A2B2C3D1。因此確定菌株K1最佳產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)溫度34 ℃、pH 7.0、接種量5%、裝液量40%。此優(yōu)化條件下濾紙酶活為98.4 U/mL，是優(yōu)化前的2.1倍。

表4 菌株K1產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme production conditions optimization

3 結論

本試驗從蘭州市榆中縣原始森林公園腐木中篩選得到分解纖維素菌株K1、K2；通過形態(tài)學觀察、生理生化特征及16S rDNA同源性比較，鑒定菌株K1、K2為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，濾紙酶活分別為45.3 U/mL、43.6 U/mL。

選取培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、初始pH值、接種量、裝液量進行單因素優(yōu)化，初步確定菌株K1發(fā)酵產(chǎn)纖維酶最佳工藝條件為培養(yǎng)時間3 d，培養(yǎng)溫度34 ℃、初始pH值7.0、接種量6%、裝液量30%，濾紙酶活為94.0 U/mL，是優(yōu)化前的2.0倍；菌株K2發(fā)酵產(chǎn)纖維酶最佳工藝條件為培養(yǎng)時間2 d，培養(yǎng)溫度34 ℃、初始pH值7.0、接種量6%、裝液量30%，濾紙酶活為86.7 U/mL，是優(yōu)化前的1.8倍。

以菌株K1為目標菌，在單因素優(yōu)化基礎上采用正交試驗優(yōu)化，初步確定影響菌株K1發(fā)酵產(chǎn)纖維酶的因素從大到小順序為培養(yǎng)溫度、初始pH值、接種量、裝液量；最優(yōu)組合條件為培養(yǎng)溫度34 ℃、初始pH值7.0、接種量5%、裝液量40%，在此優(yōu)化條件下菌株K1濾紙酶活為98.4 U/mL，是優(yōu)化前的2.1倍。