沉香型白酒酒醅理化特性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

楊 磊，程鐵轅，吳樹坤，衛(wèi)春會，黃治國*

（1.沈酒集團(tuán)有限公司，四川 瀘州 646000；2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局 國家酒類檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；3.四川省瀘州市酒業(yè)發(fā)展促進(jìn)局，四川 瀘州 646000；4.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一。中國白酒的獨(dú)特之處不僅僅是因?yàn)闅v史悠久，風(fēng)格獨(dú)特，更因?yàn)槠浒l(fā)酵方式——“開放式固態(tài)釀造、多菌復(fù)合發(fā)酵”，這在種類繁多的世界酒林中都非常罕見[1]。根據(jù)白酒的不同風(fēng)味分為濃、清、米、醬四大香型以及在此基礎(chǔ)上衍生出的其他香型。沉香型白酒是在清、濃、醬三大香型白酒的基礎(chǔ)上研發(fā)出的一種新型白酒，既繼承了傳統(tǒng)的釀造工藝，又在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行了創(chuàng)新。沉香型白酒的釀造是以加入了26種中藥材粉的高溫大曲作糖化發(fā)酵劑，將糧糟堆積發(fā)酵后，再以窖池為容器進(jìn)行發(fā)酵[2]。獨(dú)特的工藝使得沉香型白酒兼具醬、濃、清、藥等多個香型的特點(diǎn)，酒體沉香怡人、醇厚綿甜、圓潤協(xié)調(diào)、余味爽凈。

沉香型白酒作為一種新興的酒品，被譽(yù)為中國第13大香型白酒，其獨(dú)特的復(fù)合風(fēng)味越來越受到消費(fèi)者的喜愛，同時也引起了相關(guān)研究人員的關(guān)注。因此，想要更清晰的了解沉香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成需要對沉香型白酒的釀造環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究。目前，關(guān)于沉香型白酒的報(bào)道較少，吳樹坤等[3]對沉香型酒醅中芽孢桿菌（Bacillus）進(jìn)行了分離鑒定以及代謝產(chǎn)物分析，結(jié)果共分離獲得產(chǎn)香良好的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等4株菌，其風(fēng)味產(chǎn)物包含3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇等典型的風(fēng)味成分。此外，隨著高通量測序技術(shù)的成熟應(yīng)用，為研究白酒釀造過程中微生物的多樣性提供了較好的研究手段[4]。郭敏等[5]采用高通量測序技術(shù)對醬香白酒酒醅中微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，不同輪次酒醅中的微生物差異較大，其中第3輪次酒醅中優(yōu)勢菌為細(xì)菌中的乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬以及真菌中的嗜熱真菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus aurantiacus），而第7輪次酒醅中優(yōu)勢菌屬為細(xì)菌中的鹽單胞菌屬（Halomonas）和真菌中的隱球菌屬（Cryptococcus）。

本研究采用上、下層沉香型出池酒醅為試驗(yàn)對象，對酒醅基本理化特性進(jìn)行測定并提取其宏基因組，采用高通量測序技術(shù)分析其原核微生物多樣性；同時采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀分析酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味成分。旨在更深入的了解沉香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)，并為其發(fā)展和工藝條件的改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

沉香型出池酒醅；川南某酒廠，以黃水線以上為上層酒醅（編號CX01），黃水線以下為下層酒醅（編號CX1），不同酒醅均采用五點(diǎn)取樣法，并混合均勻，4 ℃保存待用。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、五水硫酸銅、葡萄糖、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；氯仿（分析純）：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-Na2、飽和酚、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-12恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺：江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；Lynx6000高速落地離心機(jī)：賽默飛世爾科技有限公司；MyCycler型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、JY-SP-C型水平電泳槽：美國Bio-Rad公司；DA-155高精度數(shù)顯酒精濃度計(jì)：上海點(diǎn)將精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅理化指標(biāo)的測定

淀粉含量、還原糖含量、酸度的測定均參考文獻(xiàn)[6]。酒精度的測定參考文獻(xiàn)[7]的方法，并采用數(shù)顯酒精計(jì)進(jìn)行酒精度的測定。

1.3.2 酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定方法參考郎召偉等[8]的研究，并做適當(dāng)調(diào)整，具體步驟如下：

樣品預(yù)處理：稱取酒醅2.0 g于頂空瓶中，55 ℃預(yù)熱15 min，采用50/30 μm DVB/CAR on PDMS固相微萃取頭萃取30 min后，230 ℃解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃；不分流；程序升溫：40 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持15 min；載氣為高純氦氣（He），載氣流速為1 mL/min。

MS條件：四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍為20～500 amu，溶劑延遲時間3 min。

定性及定量分析：質(zhì)譜圖通過與美國Agilent公司提供的標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST05a.L）比對，利用匹配度均＞80%、特征離子進(jìn)行定性分析，并鑒定結(jié)果予以確認(rèn)[9]。以乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)加入到酒醅中，使其終質(zhì)量濃度為1 mg/100 g，通過計(jì)算樣品中風(fēng)味物質(zhì)的峰面積與乙酸丁酯峰面積之比并結(jié)合乙酸丁酯的濃度來進(jìn)一步計(jì)算其含量[10]。

1.3.3 酒醅細(xì)菌多樣性分析

采用酶物理化學(xué)法[11]提取酒醅總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），具體步驟參考閆亮珍等[12]的研究。由北京百邁客生物科技有限公司完成高通量測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

酒醅理化指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，并用Excel 2010編輯作圖。將高通量測序所得序列與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得酒醅中微生物的物種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅理化指標(biāo)的測定

沉香型酒醅理化指標(biāo)的測定結(jié)果見圖1。

在白酒發(fā)酵過程中，淀粉是酒精以及其他代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。酒醅淀粉含量的測定能有效判斷原料中淀粉是否利用充分以及酒醅是否需要繼續(xù)入窖發(fā)酵，進(jìn)而可調(diào)節(jié)酒企的原料成本以及時間消耗。由圖1A可知，上層酒醅的淀粉含量達(dá)到11.94 g/100 g，而下層酒醅的淀粉含量顯著低于上層酒醅（P＜0.05），僅為6.15 g/100 g。由此可得，下層酒醅的發(fā)酵更加徹底，這是由于隨著發(fā)酵時間的進(jìn)行，窖池底部會積累大量黃水，而黃水可作為介質(zhì)能較快進(jìn)行物質(zhì)與能量的交換[13]，微生物生長代謝更加活躍，淀粉利用更加充分，而上層酒醅在發(fā)酵過程中，水分含量相對較低，物質(zhì)傳動性較差，微生物生長受限，甚至淀粉酶等酶系可能隨水分流動轉(zhuǎn)移至下層，導(dǎo)致上層酒醅淀粉利用率較下層酒醅更低。有研究表明，出池酒醅的淀粉含量可達(dá)到6%～9%[7，14]。因此，可判斷上層酒醅的淀粉利用并不充分，可再進(jìn)行多輪次的發(fā)酵。

圖1 沉香型酒醅理化指標(biāo)的測定結(jié)果Fig.1 Determination results of physicochemical indexes of Chen-flavor fermented grains

還原糖由淀粉酶、糖化酶催化淀粉而生成，是酒醅微生物發(fā)酵的主要能量來源。而白酒釀造是邊糖化邊發(fā)酵的過程，酒醅中還原糖的含量，在一定程度上能反應(yīng)酒醅發(fā)酵速度以及發(fā)酵情況。因此，還原糖含量是衡量酒醅發(fā)酵質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。由圖1B可知，上層酒醅還原糖的含量僅為0.5 g/100 g，下層酒醅還原糖的含量顯著高于上層酒醅（P＜0.05），高達(dá)2.0 g/100 g。該結(jié)果與黃治國等[14]對濃香型酒醅還原糖含量的研究結(jié)果相似。結(jié)合圖1A可得，酒醅中還原糖含量與淀粉含量呈相反的關(guān)系，這是由于還原糖具有水溶性，在酒醅發(fā)酵過程中，淀粉被淀粉酶、糖化酶分解，生成葡萄糖，同時淀粉間吸收的水分被釋放出來，并向下流動，使得下層酒醅葡萄糖含量高于上層酒醅，促使下層酒醅中微生物獲得更多的能量物質(zhì)及酶系，進(jìn)一步解釋了下層酒醅淀粉含量低于上層酒醅的現(xiàn)象。而下層酒醅中殘留的大量還原糖使其具有進(jìn)一步的利用空間。

酸度主要是由窖池內(nèi)產(chǎn)酸菌有機(jī)酸的代謝和其他酸性物質(zhì)組成。酸性環(huán)境有利于防止雜菌的污染，同時豐富的有機(jī)酸類物質(zhì)作為主要風(fēng)味物質(zhì)的同時，也為酯類物質(zhì)的生成提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖1C可知，下層酒醅的酸度顯著高于上層酒醅（P＜0.05），這是由于沉香型白酒采用窖池發(fā)酵，底部窖泥含有豐富的產(chǎn)酸菌，而下層酒醅充分接觸窖泥，同時在黃水的傳質(zhì)作用下，大量的產(chǎn)酸微生物在下層酒醅中生長代謝，而上層酒醅為固態(tài)發(fā)酵體系，產(chǎn)酸菌的遷移及生長均較慢。

酒精是窖內(nèi)發(fā)酵中最重要的產(chǎn)物，也是衡量酒醅發(fā)酵質(zhì)量的主要指標(biāo)。由圖1D可知，下層酒醅的酒精含量達(dá)到6.82 mL/100 g，顯著高于上層酒醅（P＜0.05）。這是由于下層酒醅受上層酒醅的重力作用，使得其厭氧環(huán)境更加良好，而酒精是酵母在厭氧條件下主要的發(fā)酵產(chǎn)物。結(jié)合圖1A和圖1B不難發(fā)現(xiàn)，下層酒醅中酒精含量高與其淀粉質(zhì)原料消耗的更加充分、發(fā)酵環(huán)境更加適合密不可分。

2.2 酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

采用GC-MS法對酒醅中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性半定量分析，可初步判斷酒醅中風(fēng)味物質(zhì)種類與含量的組成特點(diǎn)，總離子流色譜圖見圖2，揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及含量見表1。

由表1可知，從沉香型酒醅中共檢測出26種主要揮發(fā)性風(fēng)味成分（乙醇不納入分析），其中包含20種酯類物質(zhì)。上、下層酒醅中總酯含量分別為69.45 mg/100 g和75.49 mg/100 g，分別占總量的94.8%和86.8%，結(jié)果表明，沉香型酒醅中酯類物質(zhì)是其絕對優(yōu)勢風(fēng)味產(chǎn)物，且酒醅中產(chǎn)異香較少。該結(jié)果基本符合沉香型白酒復(fù)合香濃郁、無異雜味的特點(diǎn)。典型的風(fēng)味成分包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸、丁酸，通過比較上、下層酒醅中這些成分發(fā)現(xiàn)，上層酒醅中乙酸乙酯含量比下層酒醅高40.4%，但下層酒醅中的丁酸乙酯含量比上層酒醅高57.6%，下層酒醅中含量最高的己酸乙酯和乳酸乙酯均高于上層酒醅；此外，下層酒醅中己酸、丁酸的含量遠(yuǎn)高于上層酒醅。綜合來看，沉香型酒醅具有濃香型酒醅風(fēng)味組成特點(diǎn)，但其又含有較豐富的十六酸乙酯、亞油酸乙酯等長碳鏈乙酯。

圖2 沉香型酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ions chromatogram of volatile flavor components in Chen-flavor fermented grains analyzed by GC-MS

表1 沉香型酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及含量Table 1 Types and contents of volatile flavor components in Chen-flavor fermented grains

續(xù)表

2.3 酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 酒醅總DNA的檢測

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酒醅總DNA，結(jié)果見圖3。由圖3可知，酒醅總DNA的堿基長度均在15 000 bp左右，且條帶清晰單一，故提取效果較好，即可送樣測序。

圖3 沉香型酒醅總DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of genomic DNA of Chen-flavor fermented grains

2.3.2 序列有效性分析

圖4 沉香型酒醅樣品稀釋性曲線Fig.4 Dilution curve of Chen-flavor fermented grains samples

稀釋曲線是用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群，從而判斷測序深度是否達(dá)到測序飽和。當(dāng)曲線趨向平緩時，表明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[15]。沉香型酒醅樣品稀釋性曲線見圖4。由圖4可知，沉香型酒醅樣品的OTU數(shù)目隨測序量的增加呈先上升后趨于平緩的趨勢，因此可判定測序深度能夠反映樣本中絕大多數(shù)微生物信息，測序數(shù)據(jù)量較為合理。

2.3.3 Alpha多樣性分析

上、下層酒醅樣品中細(xì)菌群落在OTU水平下的分布情況見圖5。由圖5可知，酒醅中共獲得499個OTU，其中上層酒醅含有460個OTU，明顯高于下層酒醅（388個），表明上層酒醅的細(xì)菌多樣性高于下層酒醅。另一方面，上、下層酒醅中共有OTU數(shù)為349個，占總數(shù)的70%，而上、下層酒醅則分別單獨(dú)含有111個OTU和39個OTU，表明上、下層酒醅中大多數(shù)細(xì)菌群落是相同的，但又存在一定的差異性。

圖5 OTU分類水平下細(xì)菌的分布及韋恩圖Fig.5 Distribution and Venn diagram of bacteria at OTU taxonomic level

2.3.4 酒醅中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

將高通量測序所得序列與Silva數(shù)據(jù)庫比對，得到序列的分類學(xué)信息，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在門分類學(xué)水平下，沉香型酒醅樣品中共獲得7個門類的細(xì)菌，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fu sobacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus），這與綿甜型白酒酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似[16]。其中，厚壁菌門為絕對優(yōu)勢菌，在上層酒醅中其相對豐度＞65%，在下層酒醅中其相對豐度＞98%；而上、下層酒醅細(xì)菌門類最大的差異在于上層酒醅中含有豐富的變形菌門，相對豐度＞30%；此外，上層酒醅中的放線菌門、擬桿菌門的相對豐度也明顯高于下層酒醅。

圖6 門（A）和屬（B）分類水平下沉香型酒醅中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Bacterial community structure in Chen-flavor fermented grains at taxonomic level of phylum (A) and genus (B)

在屬分類學(xué)水平下，沉香型酒醅樣品中共獲得10個優(yōu)勢細(xì)菌屬（相對豐度＞1%），分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、Kroppenstedtia、短桿菌屬（Brevibacterium）、谷氨酸桿菌（Glutamicibacter）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅斯拜瑞氏菌屬（Roseburia）、桿菌屬（Bacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）。其中，上層酒醅中占主導(dǎo)地位的是乳桿菌屬和醋酸桿菌屬，而下層酒醅中乳桿菌屬是唯一優(yōu)勢菌。其二者之間最大的差異在于上層酒醅中醋酸桿菌屬相對豐度＞30%，而下層酒醅中相對豐度卻＜1%。相關(guān)研究表明[17-19]，乳桿菌屬、醋酸桿菌屬也是濃香型、醬香型、清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬。此外，沉香型下層酒醅更偏向于濃香型酒醅的細(xì)菌群落特點(diǎn)，二者均在發(fā)酵結(jié)束時以乳桿菌屬為唯一優(yōu)勢菌[20-22]。通過比較發(fā)現(xiàn)，上層酒醅的細(xì)菌多樣性明顯高于下層酒醅，這是由于微生物的生長受發(fā)酵環(huán)境影響較大，結(jié)合圖1C酸度的結(jié)果可得，下層酒醅的酸度顯著高于上層酒醅（P＜0.05），由于下層酒醅在酒醅發(fā)酵后期受黃水的包裹，pH值能降至3.2以下[23]，而在這種酸性較強(qiáng)的環(huán)境中，絕大多數(shù)微生物是不能正常生長的，因此導(dǎo)致上層酒醅微生物的多樣性明顯高于下層酒醅。

3 結(jié)論

通過高通量測序技術(shù)初步探究沉香型酒醅的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并對其理化指標(biāo)以及揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，理化指標(biāo)方面，上層酒醅的淀粉含量顯著高于下層酒醅（P＜0.05），而下層酒醅的還原糖含量、酸度和酒精含量均顯著高于上層酒醅（P＜0.05）。揮發(fā)性風(fēng)味成分方面，沉香型酒醅中酯類物質(zhì)是其優(yōu)勢風(fēng)味產(chǎn)物，分別占上、下層酒醅風(fēng)味含量的94.8%和86.8%；其中丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸、丁酸等典型風(fēng)味物質(zhì)在下層酒醅中的含量均明顯高于上層酒醅。細(xì)菌多樣性方面，沉香型上層酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬為厚壁菌門（Firmicutes）的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和變形菌門（Proteobacteria）的醋酸桿菌屬（Acetobacter），而下層酒醅中則以厚壁菌門的乳酸桿菌屬為其唯一的優(yōu)勢菌屬；此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，上層酒醅中細(xì)菌的多樣性較下層酒醅更為豐富。通過本研究加深了對沉香型白酒釀造的認(rèn)識，從而為沉香型白酒釀造工藝的改進(jìn)提供一定的理論基礎(chǔ)，進(jìn)而推進(jìn)沉香型白酒的發(fā)展。