褐藻膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)及酶解馬尾藻工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

汪梓旭，鄭志國(guó)，鮑時(shí)翔，朱 軍，鄒瀟瀟，黃惠琴*

（1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

我國(guó)海域遼闊，海藻資源豐富，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型海藻有100多種[1]。馬尾藻是其中常見(jiàn)的一類(lèi)熱帶、亞熱帶大型褐藻，含有豐富的膳食纖維、褐藻膠、褐藻淀粉、礦物質(zhì)、維生素等成分，其必需氨基酸含量遠(yuǎn)高于海帶和紫菜[2-4]。但由于其細(xì)胞中含有較多褐藻膠、褐藻糖膠、纖維素等不易降解的成分，直接使用時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分不能得到充分吸收[5]。通過(guò)褐藻膠裂解酶進(jìn)行馬尾藻酶解，可以將難以消化的褐藻膠分解成寡糖、單糖，從而提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6-7]。通過(guò)酶法降解制備的褐藻寡糖具有多種生理活性，如促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗凝、抗病毒等，在食品、藥品、農(nóng)業(yè)、保健品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[8-12]。

褐藻膠裂解酶是多糖裂解酶的一種，可通過(guò)β-消除反應(yīng)將褐藻膠降解為在非還原端具有雙鍵的不飽和寡糖[13]。由于其底物特異性，褐藻膠裂解酶可分為G嵌段特異性裂解酶（polyG lyase）、M嵌段特異性裂解酶（polyM lyase）及MG嵌段的雙功能褐藻膠裂解酶（polyMG lyase）[14]。迄今為止，已經(jīng)從海洋生物（藻類(lèi)、軟體動(dòng)物、細(xì)菌和真菌）、陸生細(xì)菌和病毒中鑒定出褐藻膠裂解酶[15]，其中海洋細(xì)菌是褐藻膠裂解酶的重要來(lái)源，如假單胞菌[16]、黃桿菌[17]、交替假單胞菌[18]、弧菌[19]、芽胞桿菌[20]等。本論文以實(shí)驗(yàn)室自行制備的褐藻膠裂解酶為研究對(duì)象，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和酶解馬尾藻的工藝進(jìn)行研究，為褐藻寡糖的規(guī)模化生產(chǎn)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褐藻膠裂解酶粗酶液：本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

孤囊馬尾藻（Sargassum oligocystum）：產(chǎn)自海南瓊海海域。用自來(lái)水洗去鹽分等雜質(zhì)，曬干、粉碎，過(guò)60目篩，得到馬尾藻粉末。

海藻酸鈉（食品級(jí)）、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：索萊寶生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

褐藻膠裂解酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5.0 g/L，（NH4）2SO45.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；MK2000-2E干式恒溫器：杭州奧盛儀器有限公司；ZHWY-2112B恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制備有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：瑞士布琪有限公司；DZF-6051真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠裂解酶酶活活性測(cè)定

取褐藻膠裂解酶粗酶液10 μL點(diǎn)樣于活性檢測(cè)培養(yǎng)基上，以加入滅活酶液為空白對(duì)照，室溫條件下反應(yīng)16 h后，加入10 mL 1 mol/L CaCl2溶液，5～10 min后觀(guān)察，產(chǎn)生透明圈則表明此裂解酶對(duì)聚古羅糖醛酸（polygulouronic acid，PG）的特異性；產(chǎn)生暈圈則表明對(duì)聚甘露糖醛酸（polymannuronic acid，PM）的特異性[21]。

酶活定量測(cè)定采用紫外吸收法[22]：取1.8 mL底物（3.0 g褐藻酸鈉溶于1 L 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）），40 ℃預(yù)熱5 min，加入0.2 mL待測(cè)樣品，40 ℃溫浴10 min，100 ℃加熱10 min滅活混合反應(yīng)體系，以加入滅活酶液的混合體系為空白對(duì)照，測(cè)定在波長(zhǎng)235 nm處的紫外吸收值。在上述酶活測(cè)定方法下，定義波長(zhǎng)235 nm處的紫外吸收值每分鐘增加0.1的酶量為酶的一個(gè)活力單位（U/mL）。

1.3.2 酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)

酶液制備：采用硫酸銨沉淀法[23]。將粗酶液在4 ℃條件下加入飽和度為80%的硫酸銨，靜置過(guò)夜，將溶液10 000 r/min離心30min（4℃），保留沉淀，加入少量磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH 7.0）溶解，裝入透析袋，在相同緩沖液中進(jìn)行透析處理，每隔6 h更換緩沖液，透析24 h。以透析后酶液作為酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定酶液。

溫度穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度試驗(yàn)[24]：粗酶液在不同溫度（4 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）條件下溫育1 h后，測(cè)定酶的熱穩(wěn)定性，將最高酶活定義為100%。測(cè)定在上述不同溫度條件下的酶活，以確定其最適反應(yīng)溫度。

pH穩(wěn)定性和最適反應(yīng)pH試驗(yàn)[25]：分別以Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 3～8）、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6～8）、Tris-HCl緩沖液（pH 7～9）作為底物緩沖液，以置于4 ℃保留24 h后的殘留酶活力來(lái)表征pH穩(wěn)定性。在上述緩沖液中測(cè)定酶活，確定該酶最佳反應(yīng)pH值，將最高酶活定義為100%。

不同金屬離子及化合物質(zhì)對(duì)酶活性的影響[25]：在底物中分別加入終濃度為1 mmol/L的KCl、CaCl2、NH4Cl、FeSO4、MgCl2、ZnSO4、BaCl2、MnSO4、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、尿素，研究其對(duì)酶活力的影響。定義空白組（未添加金屬離子及化合物質(zhì)）的相對(duì)酶活力為100%。

1.3.3 寡糖提取與含量測(cè)定

向酶解馬尾藻粉中加入適量無(wú)菌水，混勻，抽濾得寡糖溶液。濾渣用等量無(wú)菌水重復(fù)提取3遍，合并濾液。按照1∶100（V/V）加入30%H2O2，95 ℃加熱5 min使其脫色，放入真空干燥箱濃縮至原來(lái)的1/10，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，混勻、靜置過(guò)夜后離心，取上清液，干燥后得到粗寡糖。

寡糖含量測(cè)定：采用DNS法[26]測(cè)定。以葡萄糖醛酸作為基準(zhǔn)物質(zhì)，分別以葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度、OD540nm值為橫、縱坐標(biāo)得到葡萄糖醛酸吸光度值-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=2.401 1X+0.020 4，相關(guān)性系數(shù)R2達(dá)0.999 4。將粗寡糖溶于1 mL蒸餾水中，加入3.0 mL DNS試劑，沸水浴15 min，冷卻后定容至25 mL，測(cè)定OD540nm，根據(jù)回歸方程計(jì)算出寡糖含量。

1.3.4 馬尾藻酶解工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以寡糖含量為響應(yīng)指標(biāo)，酶解的工藝基本參數(shù)固定為含水率67%、酶解時(shí)間10 h、酶解溫度30 ℃。在基本參數(shù)下采用單因素法依次考察含水率（67%、75%、80%、83%）、酶解時(shí)間（0、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h）、酶解溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）對(duì)寡糖含量的影響。寡糖提取與測(cè)定方法參考1.3.3進(jìn)行。

響應(yīng)面優(yōu)化：根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3因素3水平試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。利用Design-Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化工藝條件。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶活性測(cè)定

由圖1可知，褐藻膠裂解酶粗酶液在檢測(cè)培養(yǎng)基上，觀(guān)察到重復(fù)試驗(yàn)1、2兩處均有兩種類(lèi)型的膠凝反應(yīng)，說(shuō)明具有PM和PG底物特異性，空白對(duì)照未發(fā)生膠凝反應(yīng)。測(cè)定其粗酶液酶活為15.20 U/mL。

圖1 褐藻膠裂解酶檢測(cè)平板上的透明圈Fig.1 Transparent zone on alginate lyase activity assay plate

2.2 褐藻膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 溫度穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度

由圖2可知，酶液在低于40 ℃的條件保溫1 h，酶活力可保持90%以上；當(dāng)溫度高于40 ℃，酶活力急劇下降，在60 ℃保溫1 h后僅剩24%酶活力，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)活性近乎喪失，說(shuō)明該酶不宜在高溫環(huán)境中貯存。由圖3可知，酶在不同溫度下表現(xiàn)出來(lái)的酶活力差異很大，最適酶促反應(yīng)溫度為50 ℃，當(dāng)?shù)陀?0 ℃或高于60 ℃時(shí)酶活性急劇降低。

圖2 褐藻膠裂解酶的溫度穩(wěn)定性Fig.2 Temperature stability of alginate lyase

圖3 溫度對(duì)褐藻膠裂解酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on alginate lyase activity

2.2.2 pH穩(wěn)定性和最適反應(yīng)pH

由圖4可知，pH為6～8時(shí)剩余酶活力均達(dá)到90%以上，pH7時(shí)剩余酶活力最高，pH3時(shí)酶活力仍達(dá)到60%。由圖5可知，在pH 8時(shí)反應(yīng)酶活性最高，在pH 7～9區(qū)間內(nèi)酶反應(yīng)活性在70%以上，由此可見(jiàn)該酶在pH接近中性時(shí)穩(wěn)定性較好。

圖4 褐藻膠裂解酶的pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH value stability of alginate lyase

圖5 pH值對(duì)褐藻膠裂解酶活力的影響Fig.5 Effect of pH value on alginate lyase activity

2.2.3 金屬離子及化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶的影響

由圖6可知，Ca2+、Mg2+和Fe2+對(duì)酶活性顯示出促進(jìn)作用，Ca2+可提高酶活16.5%，其次為Mg2+、NH2+和Fe2+等，而B(niǎo)a2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子對(duì)酶活性顯示出抑制作用。EDTA對(duì)該酶活性影響最大，剩余酶活性?xún)H約為對(duì)照組的27.1%。

圖6 不同金屬離子及化學(xué)物質(zhì)對(duì)褐藻膠裂解酶活性的影響Fig.6 Effect of different metal ions and chemical components on alginate lyase activity

2.3 馬尾藻酶解工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

圖7 含水率對(duì)褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的影響Fig.7 Effect of water content on enzymatic hydrolysis of Sargassum by alginate lyase

由圖7可知，含水率為67%～75%時(shí)，隨著含水率的提高，寡糖含量逐漸升高，當(dāng)含水率達(dá)到75%時(shí)寡糖含量為38.29 mg/g，含水率高于75%時(shí)寡糖含量無(wú)顯著提高?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)體系中增高含水率會(huì)增加后期的生產(chǎn)成本，選擇馬尾藻適宜的含水率為75%。

圖8 酶解時(shí)間對(duì)褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的影響Fig.8 Effect of enzymolysis time on enzymatic hydrolysis of Sargassum alginate lyase

由圖8可知，反應(yīng)初期隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，寡糖含量快速上升，在8 h時(shí)寡糖的增加趨于平緩，到10 h時(shí)達(dá)到最大值39.90 mg/g。因此，選擇酶解時(shí)間為10 h。

圖9 酶解溫度對(duì)褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的影響Fig.9 Effect of enzymolysis temperature on enzymatic hydrolysis of Sargassum by alginate lyase

由圖9可知，隨酶解溫度的升高，寡糖含量先快速上升，40 ℃后緩慢下降。這是因?yàn)槊复俜磻?yīng)溫度為40～60 ℃時(shí)酶活力最好，一定范圍內(nèi)提高溫度酶活增加，寡糖含量隨之提高，但升高至40 ℃后，酶的熱穩(wěn)定性急劇降低，導(dǎo)致酶活減小，寡糖的含量降低。因此，選擇最適酶解溫度為40 ℃，此時(shí)寡糖含量為40.47 mg/g。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

以含水率、酶解時(shí)間和酶解溫度為主要影響因素，以褐藻寡糖含量（Y）為響應(yīng)值，確定褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻藻粉的最佳酶解工藝條件，試驗(yàn)方案及寡糖含量如表2所示。

根據(jù)表2的結(jié)果，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由表2、表3可知，試驗(yàn)所選模型極顯著（P＜0.01）。一次項(xiàng)中酶解溫度（A）和含水率（C）對(duì)寡糖含量影響均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），二次項(xiàng)中A2、B2和C2對(duì)寡糖含量影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)中AC影響顯著（P＜0.05）；B（酶解時(shí)間）影響顯著（P＜0.05），而AB、BC影響不顯著。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，影響程度為：含水率＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得三元二次回歸方程：Y=1.86A+1.11B+7.15C+0.056AB-1.38AC-0.23BC-4.87A2-3.30B2-9.161C2+49.09。

用Design-Expert 8.0.6軟件分析模型的可信度，模型的決定系數(shù)R2=0.993 8，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.985 9。R2接近1，表明模型預(yù)測(cè)的響應(yīng)值準(zhǔn)確，可用于試驗(yàn)分析和預(yù)測(cè)。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）反映試驗(yàn)的可重復(fù)性，其值越小表明試驗(yàn)越精確，模型變異系數(shù)（CV）=2.09%＜10%；模型信噪比Adeq Precision=34.369＞4，表明模型的相應(yīng)信號(hào)足夠強(qiáng)，模型可信并可用于擬合試驗(yàn)結(jié)果。綜上分析，該模型可用于分析預(yù)測(cè)褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的工藝。

響應(yīng)面法的分析圖是特定的響應(yīng)值與自變量的三維空間圖，能直觀(guān)反映自變量對(duì)響應(yīng)值的影響程度。酶解時(shí)間含水率與酶解溫度的交互作用對(duì)寡糖含量的影響，響應(yīng)面發(fā)生了彎曲，表明其對(duì)寡糖含量的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。由圖10可知，酶解時(shí)間對(duì)寡糖含量的影響大于酶解溫度的影響，兩個(gè)因素的交互作用不顯著。同樣，圖10（b）和圖10（c）響應(yīng)面也發(fā)生了彎曲，表明含水率和酶解溫度與寡糖含量也不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，進(jìn)一步優(yōu)化得含水率對(duì)寡糖含量的影響大于酶解溫度和時(shí)間的影響。從圖10（a）可以看出含水率與酶解溫度的交互作用顯著，圖10（c）可以看出含水率與酶解時(shí)間的交互作用不顯著，以上結(jié)果與表4回歸方程方差分析結(jié)果一致。

基于軟件分析得出的最佳酶解條件為含水率75.64%、酶解時(shí)間10.31 h、酶解溫度40.69 ℃，該條件下寡糖含量理論值為50.66 mg/g。實(shí)際操作中，調(diào)整含水率為75%、酶解時(shí)間為10.3 h、酶解溫度為40.7 ℃，得寡糖含量實(shí)際值為50.42 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果符合良好，回歸方程能真實(shí)地反映含水率、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)寡糖含量的影響，模型具有可行性。

圖10 酶解時(shí)間、溫度與含水率交互作用對(duì)寡糖含量影響的響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between hydrolysis time,temperature and water content on polysaccharide yield

3 結(jié)論

通過(guò)研究酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室制備的褐藻膠裂解酶反應(yīng)最適溫度為50 ℃，最適pH值為7.0，在pH 5.0～9.0及低于40 ℃的環(huán)境中比較穩(wěn)定。Ca2+、Mg2+和Fe2+等離子對(duì)褐藻膠裂解酶有促進(jìn)作用，EDTA、Ba2+、Zn2+等有抑制作用。通過(guò)單因素和響應(yīng)面法試驗(yàn)，獲得了褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的最佳酶解工藝條件為含水率為75%、酶解時(shí)間為10.3 h、酶解溫度為40.7 ℃。此優(yōu)化條件下寡糖含量為（50.420.24）mg/g。本試驗(yàn)可為菌株HB172198產(chǎn)褐藻膠裂解酶的工業(yè)應(yīng)用和馬尾藻的固體酶解工藝提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。