赤水曬醋生產過程中品質形成的探究

吳 震，盧紅梅 *，陳 莉，秦 興，李榮源，汪 沙

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

食醋是中國傳統的調味品之一，具有悠久的歷史。傳統食醋主要采用秈米、糯米、高粱、麩皮等糧谷類為原料[1]，在糖化、酒精發酵、醋酸發酵的多邊發酵方式下制成，固態發酵工藝的多菌種發酵和多代謝產物共存賦予了食醋豐富的營養物質，使食醋具有抗菌殺菌、抗氧化、抗腫瘤、控制血糖、預防心血管疾病和減肥等功效[2-4]。

赤水曬醋是貴州省赤水市生產的一種具有地方特色的食醋產品。傳統的赤水曬醋工序復雜，從中草藥制曲到滅菌包裝總共有三十六道工序之多，整個生產周期在兩年以上[5]。唐杰等[6]通過氣相色譜-質譜（gas chromatgraphymass spectrometrometry，GC-MS）聯用技術對赤水曬醋醋液香氣成分進行檢測，結果檢出8種酸類、4種醇類、8種醛酮類、5種酯類和5種萜烯類化合物，這些香味物質糅合在一起賦予了赤水曬醋醋香、酯香融合與酸味口感醇厚的品質。楊新等[7]采用5種防腐劑對從赤水曬醋中分離得到的5株污染雜菌的防治進行研究，發現苯甲酸鈉的抑菌效果最佳，并得出了變質赤水曬醋的最佳滅菌方案。何銀等[8]對赤水曬醋中4株腐敗微生物的生長特性進行了研究，為赤水曬醋腐敗微生物的防治提供了依據。但是，關于赤水曬醋生產過程中其品質形成的機制鮮見報道。

本研究對赤水曬出生產過程中不同階段樣品的理化指標和功能性指標的變化進行測定與分析，探索赤水曬醋品質特點的形成因素和發酵工藝的特點，為后續的工藝改進奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒精發酵、醋酸發酵、曝曬階段的醋醅、醋液樣品：貴州赤水黔老翁曬醋有限公司；黔老翁兩年曬醋成品、黔老翁三年曬醋成品、黔老翁手工6°曬醋成品：市售。

1.1.2 試劑

福林酚：北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉、甲醛：成都金山化學試劑有限公司；蘆丁：貴州迪大生物科技有限責任公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸：上海試四赫維化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海梯希愛化成工業發展有限公司；亞硫酸鈉、甲基紅、一水合沒食子酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；苯酚：天津市永大化學試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C GC-MS聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；ZD-2A自動電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；FA2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；DHG-9140B恒溫鼓風干燥箱：上海瑯軒實驗設備有限公司；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 赤水曬醋工藝流程及操作要點

大米、糯米、水→煮沸→加入藥曲→酒精發酵（15 d）→加入麩皮→醋酸發酵（9～10 d）→加食鹽→發酵（4～5 d）→曝曬陳釀（1～4年）→淋醋→醋液暴曬（3個月以上）→滅菌→成品

操作要點：

（1）藥曲制備：將小麥、多種中草藥粉碎，加水攪拌混勻后裝入塑料桶壓實，將塑料桶反扣得到成形的藥曲，在溫度低于38 ℃的條件下發酵15 d后自然晾干備用，每塊干曲質量為2.3～2.4 kg。

（2）酒精發酵：將大米和糯米按質量比3∶1混勻，加入13倍質量的水，混勻，在90 ℃條件下蒸煮30 min，然后泵入發酵缸（每缸容量約160 kg，每鍋裝3缸），靜置冷卻，待醪液冷卻至室溫加入藥曲，每個發酵缸放入一塊（1）中制備的干曲，室溫發酵15 d，期間每天上午攪拌一次醪液。

（3）醋酸發酵：按照發酵缸數∶麩皮袋數（每袋35 kg）=6∶22的比例，將醪液和麩皮在混勻機中攪拌混勻后得到醋醅。將醋醅轉移至木槽（每6缸裝1槽），隨即在室溫條件下開始醋酸發酵。前期在醋醅表面覆蓋草席并每天早上翻一次醋醅，在翻拌前檢測醋醅中部位置的溫度，待醋醅中部溫度達到43 ℃，添加14 kg/槽的食鹽（一般是醋酸發酵的第9～10天，加鹽量約占每槽醋醅質量的0.9%），繼續發酵4～5 d，期間每天早上翻一次醋醅。

（4）曝曬陳釀：將醋酸發酵完成的醋醅轉移至曝曬壇中壓實，在醋醅表面撒上約500 g食鹽，蓋好壇蓋靜置發酵1～4年，期間定期檢查，根據情況添加醋醅或食鹽。當曝曬期達到要求時移出醋醅，按照醋醅與水質量比1∶1.2混勻，靜置6～8 h，使用壓濾機除去醋糟，過濾醋液至曝曬缸曝曬3個月以上（醋液過濾一般在夏季，生產中根據需要取出醋醅淋醋曬液）。

1.3.3 分析方法

（1）取樣方法

酒精發酵樣品：隨機選取3個不同的發酵缸，分別編號為1、2、3，將發酵缸中的醪液攪拌均勻，然后分別取200 mL樣品，編號為1、2、3，待測。

醋酸發酵樣品：從上述3個發酵缸所屬的醋酸發酵木槽四周和中間各取適量醋醅樣品，攪拌混勻，取約200 g樣品裝入取樣袋，編號為1、2、3，待處理。

曝曬醋醅樣品：將曝曬壇表面的食鹽移去，取離表面約為10 cm處不同位置的樣品200 g至取樣袋中，攪拌混勻，以入壇日期為相應編號，待處理。

曝曬醋醅底部樣品：在車間工人將曝曬壇中的醋醅全部挖出的過程中，直接取壇底混合醋醅200 g至取樣袋中，以入壇日期為相應編號，待處理。

醋液曝曬樣品：攪拌曝曬缸中的醋液，然后取200 mL樣品，待測。

（2）樣品處理方法

參考吳光明等[9]處理樣品的方法并稍作改動：精確稱取50 g醋醅于燒杯中，加入60 mL蒸餾水，然后使用保鮮膜封口，干燥處靜置6 h，使用中速濾紙過濾醋醅，取濾液待測。

（3）指標測定方法

還原糖的測定：參照3,5-二硝基水楊酸比色法[10]；酒精度的測定：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法[11]；淀粉的測定：參照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》中的酸水解法[12]；總酸（以乙酸計）的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法[13]；水分的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法[14]；不揮發酸（以乳酸計）的測定：參照GB 18187—2000《釀造食醋》中“不揮發酸”試驗法[15]；氨基酸態氮的測定：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法[16]；總多酚的測定：參照Folin-Ciocalteus法[17]；黃酮的測定：參照GB/T 19777—2013《地理標志產品 山西老陳醋》附錄C規定的方法[18]；DPPH自由基清除率的測定：參照李堅等[19]的方法；可溶性無鹽固形物含量參照GB 18186—2000《釀造醬油》[20]；氨基酸的測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[21]。

2 結果與分析

2.1 酒精及醋酸發酵階段理化指標的變化

2.1.1 酒精發酵階段酒精度的變化

圖1 酒精發酵階段酒精度的變化Fig.1 Changes of alcohol content during the alcoholic fermentation stage

由圖1可知，在酒精發酵階段，隨著發酵時間的延長，酒精度呈波動上升后降低的趨勢且變化幅度較小。對比山西老陳醋生產中此階段的酒精度變化（從1.3%vol增至5.7%vol）[22]，這一階段酒精含量很低，可能與原料配比及曲的酶活力有關。

2.1.2 酒精及醋酸發酵階段還原糖含量的變化

圖2 酒精及醋酸發酵階段還原糖含量的變化Fig.2 Changes of reducing sugar contents during the alcoholic and acetic fermentation stage

由圖2可知，還原糖含量在酒精和醋酸發酵階段呈波動式變化。在酒精發酵前期還原糖含量迅速降低，可能是被曲中微生物利用生成酒精和有機酸等物質所致。在醋酸發酵前期，還原糖含量迅速增加，推測是拌料時由麩皮帶入及開放的固態發酵環境提升了微生物活力，特別是好氧的、產糖化酶的微生物，加快了淀粉的糖化。在醋酸發酵中后期，還原糖含量下降，可能是鹽的加入抑制了微生物生長代謝，且醋醅中的氨基酸會與還原糖發生美拉德反應，使其含量降低。

2.1.3 酒精及醋酸發酵階段總酸含量的變化

由圖3可知，總酸含量在酒精和醋酸發酵階段均呈現前期增長明顯，后期趨于平緩的趨勢。醋酸發酵階段總酸含量增加，且仍伴隨淀粉糖化和酒精發酵，因此并未完全受到前一階段酒精度較低的限制，但對比山西老陳醋生產中此階段的總酸含量（從1.15 g/100 mL增至5.56 g/100 mL）[9]，這一階段總酸含量仍然很低，推測是受到前一階段較低的酒精度影響，也可能是對原料及麩皮中的淀粉利用不充分所致。后期增長速度放緩，推測是加鹽及酸度增加抑制了微生物的活力所致。

圖3 酒精及醋酸發酵階段總酸含量的變化Fig.3 Changes of total acid contents during the alcoholic and acetic fermentation stage

2.1.4 酒精及醋酸發酵階段氨基酸態氮含量的變化

由圖4可知，在酒精和醋酸發酵階段，氨基酸態氮含量均呈上升趨勢，酒精發酵階段波動小且含量較低，醋酸發酵階段穩定增長，后期趨于平緩。推測酒精發酵階段的氨基酸態氮主要來源于原料蛋白質的分解，但大米和糯米中的蛋白質含量較低，故分解得到的氨基酸態氮含量有限。拌入麩皮后，氨基酸態氮含量明顯增加，推測是從麩皮中析出所致。醋酸發酵階段，氨基酸態氮含量在27 d前持續快速增加，說明此階段蛋白酶活力較高。后期停止增長，可能是添加食鹽抑制了微生物發酵，說明氨基酸態氮含量與微生物的活性相關。

圖4 酒精及醋酸發酵階段氨基酸態氮含量的變化Fig.4 Changes of amino nitrogen contents during the alcoholic and acetic fermentation stage

2.1.5 酒精及醋酸發酵階段多酚和黃酮含量的變化

圖5 酒精及醋酸發酵階段多酚和黃酮含量的變化Fig.5 Changes of polyphenols and flavonoids contents during the alcoholic and acetic fermentation stage

由圖5可知，酒精和醋酸發酵階段多酚與黃酮含量變化趨勢相似，均呈上升趨勢，酒精發酵階段有一定波動且含量較低，醋酸發酵階段穩定增長，后期趨于平穩。發酵第15天時，黃酮含量僅為0.019 g/100 mL，說明黃酮與酒精發酵階段的微生物活性關系較小。醋酸發酵階段加入麩皮后，多酚和黃酮含量明顯增加。小麥麩皮大部分多酚類物質通過酯鍵或共價鍵與細胞壁相連[23-24]，發酵過程中產生的各種降解細胞壁的酶類使更多的酚類物質釋放出來，推測此階段多酚和黃酮的主要來源是麩皮析出以及醋酸發酵的生成。

2.1.6 酒精及醋酸發酵階段DPPH自由基清除能力的變化

圖6 酒精及醋酸發酵階段DPPH自由基清除率的變化Fig.6 Changes of DPPH free radical scavenging rate during the alcoholic and acetic fermentation stage

由圖6可知，酒精和醋酸發酵階段DPPH自由基清除率波動增長。酒精發酵階段DPPH自由基清除率前9天增長至48.0%，隨后趨于穩定。發酵液中溶氧可能會使甘油醛、半胱氨酸等生物分子發生氧化反應，產生超氧陰離子自由基造成DPPH自由基清除率下降[25]。中后期發酵液表面會形成白色泡沫層與空氣隔絕，減少反應發生，從而保持穩定。醋酸發酵階段，發酵液與麩皮混合后，DPPH自由基清除率約為24.0%，隨后保持增長，后期沒有受到加鹽的影響。

2.1.7 醋酸發酵階段淀粉含量的變化

圖7 醋酸發酵階段淀粉含量的變化Fig.7 Changes of starch contents during the acetic fermentation stage

由圖7可知，在醋酸發酵階段，醋醅中的淀粉含量不斷降低。對比山西老陳醋同一階段淀粉消耗量（36.57g/100g）[22]，赤水曬醋的淀粉利用率較低，醋酸發酵結束時仍有大量的淀粉殘留。主要是因為在發酵過程中酶活力偏低難以利用由麩皮帶入的大量淀粉，導致其不能被微生物有效利用，需要在進一步研究中對相應工藝進行改進。

2.1.8 醋酸發酵階段可溶性無鹽固形物

圖8 醋酸發酵階段可溶性無鹽固形物含量的變化Fig.8 Changes of soluble salt-free solids contents during the acetic fermentation stage

由圖8可知，醋酸發酵階段可溶性無鹽固形物含量緩慢上升，隨后趨于穩定。前期含量的上升可能與原料中的溶出有關；另外，這一階段微生物的生長代謝活躍，氨基酸、糖類、有機酸等物質含量均呈上升趨勢，也使得可溶性無鹽固形物含量增加。添加食鹽后，微生物的代謝活動受到抑制，導致其含量趨于穩定。

2.1.9 醋酸發酵階段不揮發酸含量變化

由圖9可知，醋酸發酵階段的不揮發酸含量波動式變化。食醋發酵過程中的不揮發酸主要是乳酸，由乳酸菌代謝生成。赤水曬醋在此階段每天都會進行翻醅處理，乳酸菌作為厭氧菌無法正常產酸。另外，醋醅中的醇類物質會與有機酸發生酯化反應，消耗部分不揮發酸。部分醋酸菌種還能以乳酸作為碳源，通過三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）將其分解為H2O和CO2，使不揮發酸含量下降。

圖9 醋酸發酵階段不揮發酸含量的變化Fig.9 Changes of non-volatile acid contents during the acetic fermentation stage

2.2 曝曬醋醅理化指標的分析

2.2.1 水分

圖10 曝曬階段醋醅中水分含量的變化Fig.10 Changes of moisture contents in Cupei during solarization stage

由圖10可知，曝曬期間醋醅樣品的含水量呈先降低后波動變化的趨勢，曝曬壇底部水分明顯增大。由于醋醅的體積縮小需要對曝曬壇補料，使樣品中的水分部分升高（第18、21、30個月）。

2.2.2 還原糖和淀粉

圖11 曝曬階段醋醅中還原糖和淀粉含量的變化Fig.11 Changes of reducing sugar and starch contents in Cupei during solarization

由圖11可知，曝曬前9個月的醋醅樣品還原糖含量逐漸增加，隨后波動下降，后期趨于平緩。曝曬前期醋醅中還原糖含量較醋酸發酵結束時有一定提升，推測是水分散失以及少量淀粉被繼續轉化為還原糖所致。醋醅曝曬階段還原糖含量不僅受水分和淀粉轉化的影響，而且乳酸菌等微生物的無氧發酵以及美拉德等生化反應的消耗也會改變其含量。

在曝曬期間，醋醅中的淀粉含量沒有明顯的變化，由于曝曬壇中屬于無氧環境，部分好氧微生物難以生存，厭氧微生物的淀粉消耗量較少。不同于曝曬壇上部醋醅干燥、堅硬的狀態，底部的醋醅含有更多水分，質地較柔軟、濕潤，微生物的活性更高，淀粉的利用率較高，造成了曝曬壇上下部分淀粉含量的差異。醋醅曝曬階段淀粉殘余量達45.88%，說明赤水曬醋現有工藝對淀粉的利用率很低。

2.2.3 酸度

圖12 曝曬階段醋醅的總酸及不揮發酸含量的變化Fig.12 Changes of total acid and non-volatile acid content in Cupei during solarization stage

由圖12可知，醋醅樣品的總酸含量隨曝曬時間的延長而升高，其不揮發酸含量呈現波動變化。與醋酸發酵階段相比，總酸和不揮發酸含量均有較大提升，可能是因為這一階段仍有產酸微生物在進行代謝活動或是水分揮發造成的。食醋中不揮發酸的百分含量小，則食醋的酸味刺鼻，后味短；反之，酸味柔和，后味長[26]。整個曝曬過程中不揮發酸百分含量都保持較高的水平，直至第33個月仍能占總酸含量的53%，這也是形成赤水曬醋優良風味的因素之一。

2.2.4 氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物

圖13 曝曬期間醋醅中氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物含量的變化Fig.13 Changes of amino acid nitrogen and soluble saltless solids content in Cupei during solarization stage

由圖13可知，醋醅樣品的氨基酸態氮含量和可溶性無鹽固形物含量均存在一定波動。這一階段水分減少造成的濃縮效應以及微生物自溶都會使氨基酸態氮含量增加，而美拉德反應對氨基酸的消耗又會使氨基酸態氮含量減少，因此表現出一定的波動。可溶性無鹽固形物含量相比于前一階段有了較大的提升，說明醋醅曝曬階段是主要的物質積累階段，對醋液品質形成具有重要的意義。

2.2.5 總酚、總黃酮及DPPH自由基清除率

圖14 曝曬期間醋醅總酚和總黃酮含量（a）及DPPH自由基清除率（b）的變化Fig.14 Changes of total phenols and flavone content (a) and free radical scavenging rate (b) of Cupei during solarization stage

由圖14可知，曝曬前24個月的醋醅樣品中的多酚和黃酮含量普遍高于其他時間，其中12至21個月的樣品最為突出，這與DPPH自由基清除率變化趨勢相近，說明較高含量的多酚和黃酮對DPPH自由基清除能力提升明顯。相比于醋酸發酵階段，多酚與黃酮含量明顯升高，可能來源于麩皮中剩余的多酚類物質析出以及曬醅階段的生成。曝曬21個月后的醋醅樣品DPPH自由基清除能力相對較低，這說明了過長的曝曬時間對醋醅的抗氧化能力有不利的影響。由曝曬期為36個月的上部和底部醋醅對比可得，盡管其多酚和黃酮含量并不突出，但底部醋醅富集了較多的發酵產物，其DPPH自由基清除能力明顯高于上部。

2.3 曝曬醋液的理化指標分析

采集市售的三款赤水曬醋產品，并對三款產品相應的曝曬期為3個月的醋液進行分析，結果見表1。

表1 曝曬期為3個月的醋液與成品理化指標對比Table 1 Comparison of physicochemical indexes between vinegar with 3 months solarization and products

由表1可知，在僅經過3個月的曝曬期之后，不同產品醋液的各項理化指標分別達到了曝曬醋醅淋出液的2～3倍，絕大部分指標已接近成品，說明日曬對于赤水曬醋品質的影響較大，是其品質特點形成的重要時期。

2.4 赤水曬醋生產過程中氨基酸的變化

選取赤水曬醋生產過程中的不同的樣品進行氨基酸分析，結果見表2。

表2 赤水曬醋生產過程中氨基酸的變化Table 2 Changes of amino acid in the production process of Chishui sun vinegar

由表2可知，酒精發酵階段的發酵液所含的氨基酸種類和含量是最少的，推測大多來源于原料的溶出。在醋酸發酵階段，氨基酸的種類、含量明顯上升，除蘇氨酸以外，其他氨基酸含量都提高了數倍，谷氨酸增長了17倍，推測是固態開放式發酵促進了微生物生長代謝，使得各種蛋白質和氨基酸能夠在醋醅中積累。在醋醅曝曬前期（12個月），水分散失使氨基酸含量增高，少數幾種氨基酸由于美拉德反應的消耗出現降低；中期時（24個月）多數氨基酸含量降低，這與同期醋醅中氨基酸態氮和還原糖含量的變化相符，推測是美拉德反應的消耗引起。一定范圍內，美拉德反應速度隨溫度上升而加快，曝曬期間醋醅內部溫度較高，美拉德反應最劇烈[27]。醋液曝曬階段氨基酸進一步濃縮，各組分含量超過其他時期，但氨基酸組成結構與醋醅發酵時相似，證明這一階段醋液體系基本穩定。

3 結論

赤水曬醋生產過程中，酒精發酵階段，酒精度較低且變化幅度小，總酸含量呈先增加后平緩的趨勢，還原糖含量整體下降，后期有所上升，推測主要轉化為乙醇和有機酸。氨基酸態氮含量升高，但升高幅度較小。多酚和黃酮含量呈上升趨勢，但總量較低且波動較大，加之發酵液溶氧的影響使DPPH自由基清除率波動增加。氨基酸的種類和含量最少，推測主要來源于原料的溶出。

醋酸發酵階段，淀粉被不斷分解轉化為還原糖，使淀粉含量降低，還原糖含量迅速上升。總酸含量上升明顯，且由于翻醅和酯化反應等因素以乳酸為主的不揮發酸呈波動變化。黃酮和多酚上升明顯，推測主要來源于麩皮的析出以及醋酸發酵中的微生物代謝。氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物同樣呈上升趨勢，各個指標在中后期加入食鹽后受到了不同程度的影響，出現了增長放緩的趨勢。氨基酸的種類和含量明顯上升，推測是固態開放式發酵促進了微生物生長代謝。

醋醅曝曬階段總酸含量呈上升趨勢，不揮發酸含量雖然有一定波動，但始終保持較高的占比。不同樣品的還原糖、可溶性無鹽固形物、多酚和黃酮含量隨曝曬時間的延長均呈現先增高后降低的變化，后續可對曝曬醋醅進行連續的跟蹤檢測，確定最佳的曝曬時間以實現工藝的優化。水分散失導致多數氨基酸含量在前期上升，后由于美拉德等生化反應消耗而減少。這一階段淀粉含量變化較小，直至結束其殘余量仍有45.88%，可考慮通過添加酶制劑等方法提高淀粉利用率。

醋液曝曬階段各項指標已經逐漸接近成品標準，此階段是赤水曬醋風格特點形成的關鍵時期。