牛黃清胃丸中化工染料檢查及天然色素成分分析

劉靜，劉匯，2，何軼，戴忠*，馬雙成*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 延吉 133002

牛黃清胃丸是由牛黃、大黃、黃芩、黃柏和番瀉葉等17味藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有清胃泄火、潤(rùn)滑通便之功效。用于心胃火盛、頭暈?zāi)垦！⒖谏嗌彙⒀例l腫痛、乳蛾咽痛、便秘尿赤[1]。處方中含有的黃芩、黃柏藥材是市場(chǎng)上常見的染色中藥，其可能存在的合成染料主要有金胺O，但其他黃色系染料如檸檬黃、日落黃、亮黃、金橙Ⅱ等也可能用于染色[2-7]。中藥安全問(wèn)題一直備受關(guān)注，從近年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)質(zhì)量分析情況來(lái)看，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，中藥染色摻偽現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[2-3]。由于中藥染色常采用化工染料，這些合成染料大都具有一定毒性，對(duì)人體健康存在嚴(yán)重安全隱患，有的甚至有致癌性，在食品領(lǐng)域被禁止使用或嚴(yán)格控制使用量[8]。中藥染色危害公眾用藥安全，欺騙消費(fèi)者，是嚴(yán)重的違法行為。因此，國(guó)家藥品監(jiān)管部門高度重視，相繼審核批準(zhǔn)了多種中藥中化工染料補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，主要有黃芩、蒲黃、紅花等，有力地打擊了中藥使用合成染料染色的違法行為[9]。因此，為更好地保障用藥安全性。本研究首先研究建立了牛黃清胃丸中檸檬黃、日落黃、亮黃、金橙Ⅱ和金胺O的HPLC檢查方法。同時(shí)，針對(duì)本品處方藥味多，所含化學(xué)成分復(fù)雜多樣，且處方中梔子、大黃等藥材中含有一些天然色素成分的情況[10-11]，筆者進(jìn)一步研究建立了這些天然色素成分指紋圖譜，為更全面地評(píng)價(jià)本品質(zhì)量提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(配備DAD檢測(cè)器)；Mettler XS105DU十萬(wàn)分之一天平、AE 3240 萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，超聲功率：300 W，頻率：40 kHz)；Milli Q純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥

金胺O、檸檬黃、日落黃、金橙Ⅱ?qū)φ掌?中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111770-201603、510004-201602、510005-201602、111769-201302)；亮黃(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；黃芩苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、大黃酸、鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110715-201619、111588-201701、111589-201705、110757-201607、110713-2016113、110795- 201710、110756-201512、110796-201621、110758- 201616)；乙腈、醋酸銨為色譜純；冰醋酸為分析純；水為超純水。

牛黃清胃丸共49 批，來(lái)源于18 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，覆蓋山西、遼寧、吉林等 18 個(gè)省區(qū)，分別為A企業(yè)(3批，樣品編號(hào)1～3，批號(hào)分別為：A17033、A16239、A17046)，B企業(yè)(2批，樣品編號(hào)4～5，批號(hào)分別為：17360701、17360401)，C企業(yè)(3批，樣品編號(hào)6～8，批號(hào)分別為：17013559、17013558、17013549)，D企業(yè)(3批，樣品編號(hào)9～11，批號(hào)分別為：17031009、111001、17041005)，E企業(yè)(3批，樣品編號(hào)12～14，批號(hào)分別為：1706153、1709126、1709130)，F(xiàn)企業(yè)(3批，樣品編號(hào)15～17，批號(hào)分別為：20161201、20170702、20170401)，G企業(yè)(3批，樣品編號(hào)18～20，批號(hào)分別為：170302、161205、170301)，H企業(yè)(3批，樣品編號(hào)21～23，批號(hào)分別為：1705021、1712033、1705026)，I企業(yè)(3批，樣品編號(hào)24～26，批號(hào)分別為：171002、170302、170301)，J企業(yè)(3批，樣品編號(hào)27～29，批號(hào)分別為：20170803、20170801、20170802)，K企業(yè)(3批，樣品編號(hào)30～32，批號(hào)分別為：111171212、11170329、11180208)，L企業(yè)(3 批，樣品編號(hào)33～35，批號(hào)分別為：117002、117003、118001)，M企業(yè)(3 批，樣品編號(hào)36～38，批號(hào)分別為：20151102、20170601、20170602)，N企業(yè)(3批，樣品編號(hào)39～41，批號(hào)分別為：170801、160703、170501)，O企業(yè)(3批，樣品編號(hào)42～44，批號(hào)分別為：170801、170301、170901)，P企業(yè)(2批，樣品編號(hào)45～46，批號(hào)分別為：20170901、20170201)，Q企業(yè)(1批，樣品編號(hào)47，批號(hào)：20170101)，R企業(yè)(2批，樣品編號(hào)48～49，批號(hào)分別為：20170701、20160602)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

取檸檬黃、日落黃、亮黃、金橙Ⅱ、金胺O對(duì)照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL中約含100 μg的混合對(duì)照溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

取大黃酸等9種對(duì)照品適量，用甲醇溶解，分別制成每1 mL中約含200 μg的對(duì)照溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 供試品溶液制備

取牛黃清胃丸2丸，加硅藻土6 g粉碎，研細(xì)，精密稱取9 g，加甲醇溶液30 mL，超聲處理30 min，放冷，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenon Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 柱；流動(dòng)相：乙腈 (A) 和0.05 mol·L-1醋酸銨(冰醋酸調(diào)pH 4.5)(B) 梯度洗脫[梯度程序I(化工染料檢查)：0～30 min，2%～70%A；30～40 min，70%～95%A；40～50 min，95%A；梯度程序Ⅱ(天然色素成分分析)：0～35 min，15%～55%A；35～45 min，55%～95%A；45～50 min，95%A]；流速：1 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：490 nm (I)、430 nm (Ⅱ)；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.4 結(jié)果

2.4.1HPLC檢查5種黃色系化工染料

2.4.1.1樣品檢測(cè) 樣品按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫程序I，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(圖1)。49批牛黃清胃丸樣品中均未檢出與上述5種黃色系對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰。

注：A.混合對(duì)照(1.檸檬黃；2.日落黃；3.亮黃；4.金橙Ⅱ；5.金胺O)；B.供試品。圖1 混合對(duì)照品和供試品HPLC圖(490 nm)

2.4.1.2檢出限 取不同濃度對(duì)照試劑溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫程序I進(jìn)樣。在490 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定，以信噪比3∶1為檢出限，結(jié)果見表1。

表1 5種化工染料對(duì)照試劑檢測(cè)結(jié)果

2.4.2天然色素成分分析

2.4.2.1方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液(批號(hào)：A17033)，按2.3項(xiàng)下色譜條件Ⅱ重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以鹽酸小檗堿為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.04%～0.5%、0.3%～2.9%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次牛黃清胃丸(批號(hào)：A17033)，按2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件Ⅱ進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以鹽酸小檗堿為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.04%～0.5%、0.3%～2.9%，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液(批號(hào)：A17033)，分別于0、6、12、18、24 h按2.3項(xiàng)下色譜條件Ⅱ進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以鹽酸小檗堿為參照峰，計(jì)算色譜圖中特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.03%～0.5%、0.4%～3.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2.2共有模式的建立與分析 取49 批牛黃清胃丸樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫程序Ⅱ進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖2。將結(jié)果導(dǎo)入Chem Pattern軟件，以所有變量作為共有峰篩選條件，采用高斯曲線模擬的方法生成共有模式，包括14個(gè)共有峰，見圖3。經(jīng)與對(duì)照品、對(duì)照藥材比對(duì)，鑒定其中9 個(gè)共有峰并明確其主要藥材來(lái)源，見表2。

2.4.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 相似度分析：利用Chem Pattern軟件，以HPLC (430 nm) 指紋圖譜共有模式為參照?qǐng)D譜，采用夾角余弦法計(jì)算各樣品的相似度，見圖4。所有49批樣品與共有模式的相似度為0.68～0.99，其中C企業(yè)樣品相似度高，均一性好；僅B企業(yè)樣品相似度低于0.7，分析發(fā)現(xiàn)其樣品部分色譜峰含量較其他企業(yè)樣品存在一定差異。

圖2 牛黃清胃丸樣品天然色素HPLC指紋圖譜(430 nm)

注：3.黃芩苷；4.西紅花苷-I；5.西紅花苷-Ⅱ；6.大黃酸；7.鹽酸小檗堿；11.蘆薈大黃素；12.大黃素；13.大黃酚；14.大黃素甲醚。圖3 牛黃清胃丸天然色素指紋圖譜共有模式(430 nm)

圖4 牛黃清胃丸樣品相似度

主成分分析：主成分分析(PCA)是根據(jù)實(shí)際需要從中抽取出幾個(gè)來(lái)盡可能多地反映原來(lái)變量信息的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。利用Chem Pattern軟件將樣品測(cè)定數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析，見圖5。第一主成分(PC1) 的貢獻(xiàn)率為40.28%，第二主成分(PC2) 的貢獻(xiàn)率為25.21%，第三主成分(PC3) 的貢獻(xiàn)率為18.27%，累計(jì)達(dá)到83.76%，說(shuō)明其能較全面地反映樣品間的差異。PCA散點(diǎn)圖顯示，不同企業(yè)生產(chǎn)樣品基本可以各自聚為一類，其中B企業(yè)樣品明顯偏離其他樣品。主成分載荷圖給出各色譜峰在主成分中所占的比例，其中離X=0 軸距離越遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)PC1的貢獻(xiàn)越大，如西紅花苷Ⅰ和大黃酚；而離Y=0軸距離越遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)PC2的貢獻(xiàn)越大，如大黃酚和西紅花苷Ⅰ；而離Z=0軸距離越遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)PC3的貢獻(xiàn)越大，如西紅花苷Ⅰ和鹽酸小檗堿。以B和C企業(yè)為例，兩者樣品主要沿PC2、PC3得到分離，因而對(duì)PC2、PC3貢獻(xiàn)大的成分是其主要差異性成分；因B位于PC2<0，PC3<0的位置，C位于PC3>0，PC3>0的位置，所以與PC2負(fù)相關(guān)、與PC3正相關(guān)的成分大黃酚在B樣品中含量較高；與PC2、PC3均正相關(guān)的成分鹽酸小檗堿在B樣品中含量較低。

注：A.得分圖；B.載荷圖。圖5 牛黃清胃丸樣品PCA分析結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法考察

采用超聲提取方式，分別考察不同提取溶劑(甲醇、80%甲醇-水)、提取時(shí)間(超聲30、45、60 min)等條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間影響不大，甲醇提取樣品中天然色素成分信息豐富，基線分離情況良好。

3.2 色素成分分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，盡管所有樣品在490 nm下均未檢出5種黃色系化工染料，但在430 nm波長(zhǎng)下可見色譜峰信息豐富，因此研究建立了這些天然色素成分指紋圖譜，并進(jìn)一步分析鑒定其中9個(gè)主要共有峰，結(jié)果表明，這些成分主要來(lái)源于處方中大黃、番瀉葉、黃柏、黃芩和梔子等5味藥材。此外，通過(guò)Chem pattern軟件分析，49批樣品與共有模式的相似度為0.68～0.99，其中僅B企業(yè)樣品相似度低于0.7，分析發(fā)現(xiàn)其樣品部分色譜峰含量較其他企業(yè)樣品存在一定差異；主成分分析能夠明確不同企業(yè)產(chǎn)品中差異較大的成分，其在一定程度上也反映了不同企業(yè)相關(guān)藥材的質(zhì)量及投料情況。此外，個(gè)別企業(yè)樣品批間存在一定差異，分析表明因部分色譜峰含量不同所致。

3.3 結(jié)論

所有樣品均未檢出檸檬黃、日落黃、亮黃、金橙Ⅱ和金胺O這 5種黃色系化工染料。同時(shí)，研究建立的天然色素成分指紋圖譜準(zhǔn)確、可靠、簡(jiǎn)便，能夠反映不同企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量，為更好地控制制劑質(zhì)量提供了參考。