HPLC同時(shí)測定虎杖根不同部位中的5種活性成分△

孔德暄，朱映睿，朱蔚然，傅敏，王光忠，2*

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065

虎杖為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根。具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。可用于濕熱黃疸，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷，肺熱咳嗽等病癥[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，虎杖具有抗炎、抗菌、抗血栓、保護(hù)心肌、抗氧化、抗腫瘤等作用[2-6]，其主要含有二苯乙烯、蒽醌及黃酮類等成分，其中二苯乙烯類主要有白藜蘆醇和虎杖苷及其衍生物；蒽醌類成分主要有大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素-8-單甲醚、蒽苷A、蒽苷B等；黃酮類成分主要有槲皮素及其苷等[7]。2015版《中華人民共和國藥典》中虎杖藥材和飲片以虎杖苷、大黃素的含量作為控制質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[1]，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也多數(shù)對虎杖中的大黃素、虎杖苷及白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測[8-9]，但是虎杖中還含有很多其他的有效成分，只選兩三個(gè)有效成分并不能全面控制虎杖的質(zhì)量。

近年來，隨著人們對虎杖中主要活性成分白黎蘆醇研究的不斷深入，其開發(fā)利用的領(lǐng)域在不斷擴(kuò)展，資源消耗量日漸增大。虎杖的應(yīng)用包括根(皮、木質(zhì)部)、根莖(皮、木質(zhì)部)、莖、葉等部位，不同部位質(zhì)地、色澤、成分和作用均有差異。為此，本研究圍繞虎杖根、根莖藥用部位中含有的虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚等主要活性成分的分布進(jìn)行分析評價(jià)[10-11]，旨在為虎杖資源的科學(xué)合理利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀(VWD檢測器)；Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SK7200HP超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；XSE105DU十萬分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；AL204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

虎杖(批號分別為：151201、151202、151203、181012、181013、181014，采自湖北省房縣)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生生藥教研室余坤教授鑒定為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根。虎杖苷(批號：H-012-161216，純度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；白藜蘆醇(批號：B-002-170426，純度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(批號：D-018-171216，純度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；大黃素(批號：151215，純度≥98.0%，四川省維克奇生物科技有限公司)；大黃素甲醚(批號：151024，純度≥98.0%，四川省維克奇生物科技有限公司)。水為重蒸餾水，乙腈、甲醇為色譜級乙腈，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1混合對照品溶液配制 分別稱取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚適量，色譜甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度分別為1.022、0.203、0.95、0.45、0.48 mg·mL-1的對照品儲備液。

分別精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚對照品儲備液適量，置5 mL容量瓶中，色譜甲醇定容至刻度，搖勻，即得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為204.4、40.6、190.0、90.0、96.0 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液制備 精密稱取虎杖樣品粉末0.2 g，精密加入60%乙醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲30 min，冷卻，稱質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為純乙腈(A)和水(B)，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為290 nm，柱溫為40 ℃。線性梯度洗脫(0～40 min，15.0%～50.0%A；40～60 min，50.0%～90.0%A)。供試品溶液和混合對照品溶液色譜圖見圖1～2。

注：A.根莖；B.根；C.根莖表皮；D.根表皮；E.根莖木質(zhì)部；F.根木質(zhì)部；1.虎杖苷；2.白藜蘆醇；3.大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷；4.大黃素；5.大黃素甲醚。圖1 虎杖不同藥用部位色譜圖

注：1.虎杖苷；2.白藜蘆醇；3.大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷；4.大黃素；5.大黃素甲醚。圖2 虎杖混合對照品色譜圖

2.3 線性范圍考察

吸取混合對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻。按2.2項(xiàng)下色譜條件不同濃度對照品均進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。表1結(jié)果表明，5種成分的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r均大于0.999。

表1 虎杖5種成分檢測方法線性范圍考察結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液1份，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，計(jì)算得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚RSD分別為0.3%、0.2%、0.4%、0.1%、0.2%，說明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，測定峰面積，得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.8%、0.6%、0.4%、0.3%、1.2%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照2.2項(xiàng)下色譜條件測定其含量，計(jì)算得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.23、2.13、18.97、7.16、14.82 mg·g-1，其RSD分別為0.9%、0.8%、1.0%、0.7%、0.8%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

取同一批樣品6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加虎杖苷(1.022 mg·mL-1)1.5 mL、白藜蘆醇(0.203 mg·mL-1)1 mL、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(0.95 mg·mL-1)1 mL、大黃素(0.45 mg·mL-1)2 mL、大黃素甲醚(0.48 mg·mL-1)3 mL，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照2.2項(xiàng)下色譜條件分別測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚的平均回收率分別為98.8%、98.6%、98.5%、98.4%、98.6%，RSD分別為0.6%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%，結(jié)果見表2。

表2 虎杖5種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

續(xù)表2

2.8 虎杖中5種化學(xué)成分的含量測定

精密量取6份不同批次的樣品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算虎杖根不同部位中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的含量，結(jié)果見表3。

表3 虎杖不同藥用部位5種成分含量測定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

為了提高分析的靈敏度和精確度，本文考察了不同流動(dòng)相組成(甲醇-水、乙腈-水)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，流動(dòng)相采用乙腈-水梯度洗脫，能夠獲得良好的色譜分離效果。采用UV檢測器對檢測波長進(jìn)行了考察，根據(jù)5種對照品的紫外-可見吸收光譜，虎杖苷和白藜蘆醇在310 nm左右有最大吸收，而大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚在290 nm和 440 nm左右有最大吸收。綜合考慮，選擇290 nm作為檢測波長。

3.2 供試品溶液制備的優(yōu)化

為了使5種活性成分能被更完全地提取出來，本研究對提取溶劑(80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇和甲醇)、提取時(shí)間(10、20、30、40 min) 等影響因素進(jìn)行考察，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，以60%乙醇為提取溶劑、超聲提取 30 min 制備樣品的色譜圖峰面積相對較大，化合物總含量相對較高，故最終確定供試品的制備方法：60%乙醇超聲提取30 min。

本實(shí)驗(yàn)對虎杖的根莖、根、根莖表皮、根表皮、根莖木質(zhì)部、根木質(zhì)部中的虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚5種活性成分進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，虎杖苷在根莖表皮中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為72.48 mg·g-1；白藜蘆醇和大黃素在根表皮中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為8.83 mg·g-1和23.96 mg·g-1；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷在根莖木質(zhì)部中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為40.57 mg·g-1；大黃素甲醚在根莖木質(zhì)部中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為17.24 mg·g-1。因此在采收虎杖藥材時(shí)表皮盡量不要破損，要盡量保存其根及根莖的完整，最大程度上保留虎杖的有效成分。方法學(xué)考察結(jié)果表明本方法具有很好的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度和回收率，說明該方法準(zhǔn)確、可靠。

白藜蘆醇及虎杖苷具有抗腫瘤、降血脂、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)脂蛋白代謝、保肝、抗氧化、抑菌等多種藥理作用，而以大黃素、大黃素甲醚為代表的蒽醌類化合物具有抗菌、保肝、瀉下、抗癌等功能[12]。檢測分析結(jié)果提示，為了更好利用虎杖活性成分、提高療效，可根據(jù)臨床需要選擇不同部位入藥。該研究為虎杖資源的合理利用提供了科學(xué)依據(jù)。