親水色譜-超高效液相-串聯質譜法測定滇橄欖中水解氨基酸研究△

王荌，車彥云，夏杰，李松梅，仇嘉，趙毅*

1.云南省中醫醫院 科研部，云南 昆明 650021；2.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500

滇橄欖又叫云南余甘子，在云南省的大部分區域種植面積較大，為云南省的特色藥食兩用植物資源，在中醫學中具有潤肺化痰、清熱利咽等功效[1-2]，同時也具有抗氧化、抗腫瘤和防衰老等活性功能[3-7]。

滇橄欖中的研究主要集中于其中的酚類、生物堿、萜類、甾醇和苷類化學成分及其相應的生物活性等[8-11]。近年來，相關的研究報道了滇橄欖中的氨基酸、維生素C、鉀和鎂等含量相對較高[12-14]，受到了食品及保健品行業的廣泛關注。氨基酸作為滇橄欖中的營養成分之一，在滇橄欖的生長、代謝轉化等方面起到了重要的作用，但是對于滇橄欖中的氨基酸含量測定卻少有關注。

常見的氨基酸中除苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸在近紫外區具有紫外吸收，其余氨基酸都沒有吸收，因此，通常需要將氨基酸衍生化后進行測定。我國的國家標準GB 5009.124—2016(食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定)中采用鹽酸水解蛋白質為氨基酸后，通過茚三酮柱后衍生法進行測定，但是該方法所使用的氨基酸分析儀專用于氨基酸測定，使用范圍較窄，且使用的離子交換柱隨著進樣次數的增大易受到污染，活化和清洗過程較麻煩，而相關的文獻采用了不同的柱前衍生試劑，經衍生化后利用高效液相色譜法進行測定[15-19]，但是這些方法的衍生化過程較復雜費時，且利用高效液相色譜的分析時間較長，不利于日常的快速檢測工作。

本研究采用國家標準中的鹽酸水解方法，將滇橄欖中的蛋白質水解為游離氨基酸后通過DE-52纖維素去除氯離子后直接進行超高效液相色譜-串聯質譜分析，同時探討了氨基酸特別是亮氨酸和異亮氨酸等同分異構體在常規的C18和HILIC親水色譜柱上的不同保留行為，以期建立快速高效的滇橄欖中水解氨基酸的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。

1 儀器與材料

API4000三重四極桿串聯質譜儀(美國AB Sciex公司)；1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；渦旋振蕩器(美國Thermo Scientific公司)；BSA124S電子分析天平(德國Sartorius公司)；TGL-15B 高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國merck公司)；濃鹽酸、乙酸銨(分析純，上海國藥集團)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；DE-52纖維素(英國whatman公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；17種氨基酸標準品(L-胱氨酸濃度為 1.25 μmol·mL-1，其余濃度都為2.5 μmol·mL-1，溶劑為0.05 mol·mL-1HCL溶液，美國Sigma公司)。10批滇橄欖采自云南省楚雄州元謀縣，經云南省中醫醫院夏杰主任中藥師鑒定為正品。

2 方法

2.1 標準溶液的配制

利用甲醇將氨基酸混標稀釋為20 μg·mL-1的標準儲備液，低溫避光保存。

2.2 樣品前處理

滇橄欖樣品經干燥粉碎后，準確稱取1.000 0 g于水解管中，加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液，抽真空后封管，于110 ℃烘箱中水解20 h后冷卻過濾并定容至25 mL，取1 mL濾液利用旋轉蒸發儀蒸干后，再用5 mL水復溶，取1 mL溶解液于離心管中，加入100 mg DE-52凈化材料，渦旋1 min后過濾膜后待測。

2.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，(100 mm×1 mm, 1.7 μm)；Waters XBridge BEH Amide色譜柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相A為1 mmol·L-1乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸，V/V)，B為乙腈，梯度洗脫(0～20 min，10%～90%A；20～25 min，90%A；25～26 min，90%～10%A;26～35 min,10%A)，柱溫35 ℃；流速500 μL·min-1；進樣量2 μL。

2.4 質譜條件

采用ESI正離子源，多反應監測模式(MRM)，各氣體流速為：氣簾氣20 L·h-1，霧化氣55 L·h-1，輔助氣55 L·h-1，加熱頭加熱溫度為550 ℃，噴霧電壓為5500 V。17種氨基酸的離子對參數參照文獻[20-21]并根據實際情況進行優化，結果見表1。

表1 氨基酸質譜參數

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化

本研究中首先選擇了常用的C18超高效色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)，但是氨基酸的極性較大，已將流速降為0.15 mL·min-1，流動相比例調整為甲醇：0.1%甲酸-水溶液(含1 mmol·L-1乙酸銨)=5∶95，但是大部分氨基酸在C18色譜柱上的出峰時間較早，保留較差，較早的出峰會伴隨著大量的大極性干擾物質進入質譜，存在一定的基質效應。

鑒于大部分氨基酸在C18色譜柱上的保留較差，且亮氨酸和異亮氨酸屬于同分異構體，分子量相同且質譜檢測時的母離子和子離子都相同，C18柱無法實現基線分離。因此，本研究中又采用了適用于大極性化合物分離的HILIC親水色譜柱(XBridge BEH Amide，250 mm × 4.6 mm，3.5 μm，美國Waters公司)進行分離，達到了較好的分離效果，17種氨基酸的總離子流圖見圖1，亮氨酸和異亮氨酸在不同色譜柱上的色譜圖見圖2～3。

圖1 17種氨基酸的總離子流圖

圖2 亮氨酸和異亮氨酸在C18色譜柱上的色譜圖

圖3 亮氨酸和異亮氨酸在HILIC色譜柱上的色譜圖

3.2 氯離子的去除方式優化選擇

滇橄欖經過鹽酸水解后，不僅得到了各個單體氨基酸，而且也將樣品中的部分大分子化合物水解為小分子化合物，利于后續的測定工作，但是鹽酸水解后在樣品溶液中帶入了大量的氯離子，鹵素元素進入質譜后會對其有一定的腐蝕性。因此，滇橄欖在水解后首先需要將其中的氯離子去除。

首先我們選擇了弱陰離子吸附劑氨丙基(NH2)和強陰離子吸附劑氨丙基(SAX)作為代表進行比較研究，最終氯離子的含量以硝酸銀滴定結果表示，在滇橄欖水解溶液中分別加入適量的NH2和SAX凈化填料，結果表明，NH2和SAX都能夠吸附一定量的氯離子，NH2的吸附能力較SAX差，但是NH2和SAX吸附氯離子的同時也將氨基酸進行吸附，特別是對于天冬氨酸和賴氨酸等多氨基/多羧基氨基酸的吸附較強，回收效果較差。

根據文獻報道[22]，DE-52凈化材料能夠有效地對氯離子進行吸附，而且DE-52屬于陰離子交換型二乙氨基乙基纖維素材料，在溶液環境中處于中性狀態，常規條件下對于氨基酸的吸附較少。本研究中針對陰離子交換纖維素的代表DE-23、DE-32和DE-52，分別于1 mL氨基酸水解稀釋液中加入50 mL DE-23、DE-32和DE-52，比較其對氯離子的吸附效果，結果表明DE-23和DE-32對于氯離子的吸附效果較差，吸附能力只有30%作用，而DE-52對于氯離子的吸附能力都達到70%以上，根據DE-23、DE-32和DE-52的相關物理參數，3種材料的離子容量(Small ion capacity)都為0.88～1.08 meq·dg-1，但是DE-23和DE-32的填集密度(Packing density)分別為0.15、0.24 g·mL-1，而DE-52的填集密度分別為0.9、1.1 g·mL-1，遠大于其他2種材料，因此相對于DE-23和DE-32對于氯離子的吸附效果好。

本研究中也對DE-52的用量進行了優化比較，分別于1 mL氨基酸水解稀釋液中加入10、30、50、70、90 mg DE-52凈化材料，比較其對氯離子的吸附效果，結果見圖4，當DE-52凈化材料的用量為10 mg和30 mg時對于氯離子的吸附量不夠，當添加量為50 mg時達到最大的吸附量(89%)，隨后增加凈化材料的用量對于氯離子的吸附效果沒有明顯的變化，因此，選擇DE-52凈化材料的用量為50 mg最佳。

圖4 DE-52用量對于氯離子吸附效果

3.3 線性范圍和檢出限試驗

將17種氨基酸標準溶液利用甲醇分別稀釋成不同的濃度，測定其峰面積并分別對其濃度進行線性回歸分析，確定各氨基酸的線性范圍和相關系數。利用滇橄欖干燥粉末，加入適量的氨基酸標準溶液，按照上述的前處理和測定方法，以信噪比(S/N)分別為3倍和10倍時所對應的檢測濃度作為本方法的檢出限和定量限，見表2，17種氨基酸在0.000 3～2.0 μg·mL-1線性關系較好，定量限和檢出限均可滿足滇橄欖中17種氨基酸的測定需求。

表2 滇橄欖中17種氨基酸的線性范圍、相關系數(r)、檢出限和定量限

3.4 回收率和精密度試驗

通過對滇橄欖干燥粉中分別加入不同濃度的氨基酸標準溶液，測定氨基酸含量并扣除滇橄欖中氨基酸本底含量后得到測定含量，并與添加含量相除得到回收率，添加質量分數為定量限、5倍和10倍定量限，每個添加質量分數做6次平行試驗并計算RSD以進行精密度考察。結果表明，17種氨基酸的平均回收率為73.8%～98.8%，RSD為3.25%～7.79%。

3.5 實際樣品測定

分別對云南省楚雄州元謀縣采集的10個滇橄欖樣品進行氨基酸含量分析，結果見圖5，滇橄欖中氨基酸總量為0.751%～1.082%，氨基酸含量較高。滇橄欖中精氨酸含量較高，質量分數為0.142%～0.219%，天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸和胱氨酸含量處于同一水平，質量分數為0.041%～0.124%，丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和絲氨酸的質量分數處于同一水平，為0.011%～0.056%。研究表明，精氨酸能夠有效改善免疫系統健康、治療心血管、降血壓和膽固醇、促進生長激素的生成，具有較好的保健功能，也增強了滇橄欖的生物保健功能。

表3 滇橄欖中17種氨基酸的回收率和RSD(n=6)

圖5 滇橄欖中各氨基酸含量

4 結論

本研究利用親水色譜，結合超高效液相色譜-串聯質譜建立了滇橄欖中17種水解氨基酸的測定方法。滇橄欖樣品經鹽酸水解后，利用DE-52纖維素去除氯離子后，采用ESI正離子MRM監測模式，外標法定量，具有較好的準確度和精確度，適合滇橄欖中氨基酸的測定。