人腸道微生物中抗菌活性菌株的篩選及其代謝產物研究△

李德利，丁鵬敏，劉雙月，楊秀偉，王如峰*

1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488；2.北京大學 藥學院，北京 100083

腸道微生物是指一群生活在動物腸道內的微生物群落，其體系龐大，種類和數量繁多，在進化過程中一直維持著動態平衡。腸道微生物主要由厚壁菌門和擬桿菌門的種類組成，另有少量變形菌門、放線菌門、疣微菌門和梭桿菌門的種類[1]。腸道微生物動態平衡的維持是微生物之間、微生物與宿主之間相互作用的結果。已有研究表明，定植抗性是腸道內部維持穩態的關鍵[2]。作為不同的生物體系，微生物與微生物之間，以及微生物與人體之間的相互作用應該通過分泌和接受化學介質來實現。與高等生物一樣，腸道微生物也存在初生代謝和次生代謝，其代謝產物分泌到腸道中會對周圍的微生物產生影響，這應該是實現微生物定植抗性的關鍵因素。通過分泌這些代謝產物，特別是具有生物活性的代謝產物，某種腸道微生物影響其他微生物的生存和發展，使自身在生存競爭中處于有利地位，這些活性代謝產物被人體吸收后也應該對人體的健康產生影響。

有研究報道奇異變形桿菌Proteusmirabilis對病原菌如白色念珠菌Candidaalbicans和鰻弧菌Vibrioanguillarum具有較強抑制活性[3]，從而有助于其生存并對其宿主有一定的保護作用。奇異變形桿菌屬于腸桿菌科的變形桿菌屬(Proteus)，該屬主要包括普通變形桿菌P.vulgaris、奇異變形桿菌P.mirabilis、彭氏變形桿菌P.penneri、黏液變形桿菌P.myxofaciens、豪氏變形桿菌P.huuseri和3個未命名的基因種[4]。變形桿菌是腸道內常見的條件致病菌，正常情況下與宿主共生，參與調節菌群穩定，只在菌群紊亂時才具有致病性。在海洋動物的腸道中分離出的普通變形桿菌、奇異變形桿菌和彭氏變形桿菌體現出益生菌特性，這主要與細菌素的產生及其對致病菌的拮抗作用有關[5]。

既然腸道微生物可能通過分泌化學物質對其周圍的微生物和宿主產生影響，這些化學物質到底是什么？它們通過什么機制來實現？這些問題的答案可能是揭示腸道菌群與人體健康關系的金鑰匙。因此，開展腸道微生物的代謝產物研究，對于闡明腸道微生物與人體疾病發生機制和藥物作用機制相關性的物質基礎具有重要意義。鑒于此，筆者以變形桿菌為例，開展了此類研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞便樣品來源于健康成年志愿者。指示菌株為本實驗室凍存菌株：金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、奇異變形桿菌Proteusmirabilis、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、大腸埃希菌Escherichiacoli、腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis。

DNA-marker、細菌DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自博邁德科技發展有限公司；成套變形桿菌生化鑒定管購自青島海博生物技術有限公司；細菌通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；培養基成分購自北京奧博星生物科技有限公司；化學試劑正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚等購自北京化工廠；其他實驗耗材如牛津杯、96孔板、微孔濾膜等由北京蘭博利德商貿有限公司提供。

1.2 儀器

MLS-3780高壓滅菌鍋(日本Sanyo公司)；JB-CJ-1500超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化設備有限公司)；EPOCH全波長酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；PCR反應擴增儀(加拿大BBI公司)；DK-8D型穩壓溫流電泳儀(上海斯特分析儀器有限公司)；恒溫振蕩培養箱(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)。

1.3 培養基

營養肉湯培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，調節pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

營養瓊脂培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL，調節pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

改良高氏一號培養基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20.0 g，重鉻酸鉀50.0 mg，蒸餾水1000 mL，調節pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

發酵培養基：大豆蛋白胨10.0 g，蛋白胨2.0 g，葡萄糖20.0 g，可溶性淀粉5.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32.0 g，蒸餾水1000 mL，調節pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

1.4 活性菌株分離

取志愿者糞便適量置于無菌0.9%氯化鈉溶液中，150 r·min-1振蕩1 h，使糞便充分分散，靜置，上清液即為混合菌液。采用梯度稀釋法將混合菌液稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7，分別吸取各梯度稀釋液接種于改良高氏一號液體培養基中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養12～24 h，獲得混合菌群。將所得混合菌群用稀釋涂布法接種于營養瓊脂培養基中，待菌落長成后，用接種環挑取優勢單菌落，劃線法接種于營養瓊脂培養基中。將長成的菌落進一步純化，得到單菌株。

1.5 活性菌株篩選

1.5.1樣品預處理 將純化得到的單菌株用營養肉湯培養基培養活化且培養至穩定后，分別以2%的接種量接種于5 mL發酵培養基中，于37 ℃、150 r·min-1搖床培養3～7 d。吸取各單菌株發酵液，5000 r·min-1(離心半徑為6.60 cm)離心10 min，取上清液，經0.22 μm無菌濾膜過濾后，于4 ℃保存。

1.5.2抗菌活性篩選 采用牛津杯法驗證發酵液活性：指示菌(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌)菌液濃度分別調至1.5×108CFU·mL-1，吸取100 μL接種至固體培養基，表面放置牛津杯，管內加150 μL待測樣品，以空白培養基為實驗對照組，每組設置3個重復。平皿37 ℃靜置8～16 h，通過觀察牛津杯周圍有無透明圈確定發酵液樣品有無抗菌活性，用直尺測量透明圈的直徑并記錄，結果取平均值。

1.6 活性菌株分類鑒定

1.6.1生理生化鑒定 參考文獻[6]變形桿菌的鑒定方法，采用成套變形桿菌生化鑒定管進行鑒定。

1.6.216S rDNA鑒定 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液DNA，采用35 μL反應體系進行16S rDNA序列全長擴增，所用引物為細菌通用引物(27F：5′ AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG 3′；1492R：5′ TACGG YTACC TTGTT ACGAC TT 3′)。反應體系：模板3 μL，上下游引物各1 μL，5×fast Pfu Buffer 7 μL，2.5 mol·L-1dNTP 3 μL，FastPfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 19 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性1 min，51 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循環35次，72 ℃延伸5 min，反應結束后于4 ℃保存。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統的擴增效果并拍照，將擴增成功的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。測序結果與GenBank中已知的核酸序列比對，從中選取同源性較高的序列，再用DNAMAN軟件比對，并用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

1.7 活性物質提純及結構鑒定

1.7.1活性物質定位 取預處理后的發酵上清液和空白培養基，分別加至3 kD的超濾管中，以離心半徑6.60 cm、7000 r·min-1離心25 min，取下層濾液即為除蛋白后樣品和空白培養基。采用微量稀釋法，測定添加不同體積的樣品后對銅綠假單胞菌指示菌的生長抑制率。具體操作如下：用營養肉湯培養基將活化后的銅綠假單胞菌菌液調整濃度至1.5×107CFU·mL-1，取96孔板，分別加入20、30、40、50、60 μL待測樣品，對照組加同量的空白培養基，再加入菌液20 μL。用培養基補足體積至200 μL，每組設置4個重復孔。將96孔板置于微量振蕩器上振蕩幾分鐘以充分混勻，37 ℃培養8～12 h。培養結束后將孔板取出，用酶標儀測定各組在600 nm處的吸光度值(A)。將實驗結果與相同條件下不除蛋白的發酵液和空白培養基的抑制率進行比較，分析發酵液去除蛋白前后抗菌活性的變化。按公式(1)計算抑制率。

(1)

1.7.2活性物質提取 采用有機溶劑萃取法提取發酵液中的活性物質，運用1.5.2中所述的牛津杯法比較不同極性溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)依次萃取和直接萃取得到的萃取相和萃余相活性，確定最佳提取溶劑。

1.7.3活性物質純化與結構鑒定 以銅綠假單胞菌為活性追蹤指示菌，運用大孔樹脂吸附柱色譜法、薄層色譜法、硅膠柱色譜法、凝膠柱色譜法和高效液相色譜法，對發酵液中的活性物質進行分離純化。利用質譜技術、核磁共振技術對所得純化合物進行結構鑒定。

1.8 化合物抗菌活性測試

將各化合物用DMSO溶解后，加水稀釋至適宜濃度，以銅綠假單胞菌為指示菌，采用微量稀釋法測定化合物的最低抑菌濃度(MIC)，96孔板內化合物的終質量濃度為500、250、125、……0.98 mg·L-1，DMSO的終質量分數為5% ，以無菌生長的最低濃度為單體化合物的MIC，實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 活性菌株分離篩選

通過改良高氏一號培養基直接培養法縮減腸道微生物的種類，剔除了大部分對重鉻酸鉀敏感的腸道菌，最終從人源糞便中篩選得到1株具有廣譜抗菌活性的菌株，編號為HA-3151。該菌株發酵液能抑制金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的生長，在牛津杯周圍能看見清晰的透明圈，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑約為15.9 mm(見圖1，A、B)，對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑約為16.4 mm(見圖1，C、D)。此外對奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌的生長也有抑制作用，其抑菌圈直徑大小見表1。

注：A、B.金黃色葡萄球菌；C、D.銅綠假單胞菌。圖1 菌株HA-3151發酵液的抑菌圈展示圖

表1 菌株HA-3151對指示菌的抑菌結果

2.2 活性菌株鑒定

2.2.1生理生化鑒定 結合菌落形態和革蘭氏染色陰性結果，對菌株HA-3151的生理生化實驗結果(表2)進行分析，初步判定HA-3151為腸桿菌科變形桿菌屬普通變形桿菌P.vulgaris。

表2 菌株HA-3151生理生化鑒定結果

注：+為陽性；-為陰性。

2.2.216S rDNA鑒定 PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳成像結果見圖2，各樣品在1500 bp左右有明亮單一條帶，無雜帶污染。測序后發現其16S rDNA序列全長為1476 bp。

注：M. DNA Marker; 1～6. PCR產物。圖2 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

通過與GenBank數據庫的同源性比較，結果顯示菌株HA-3151與變形桿菌屬同源性最高。根據Blast比對結果，下載了有文獻報道的變形桿菌屬的代表菌株序列，采用MEGA 5.0軟件進行1000次相似重復度計算，構建系統發育樹見圖3。從圖3可知，HA-3151與普通變形桿菌P.vulgaris聚在同一分支，可信度值為100。

圖3 菌株HA-3151的系統發育樹

2.3 活性物質提純及結構鑒定

2.3.1活性物質定位 超濾法除去蛋白質的發酵液與未除蛋白質的發酵液對銅綠假單胞菌生長的抑制率見圖4，兩者差異無統計學意義。在加入體積為60 μL(終體積為200 μL)時，兩者都完全抑制銅綠假單胞菌的生長。

圖4 發酵液去除蛋白質前后抑菌活性對比

2.3.2活性物質提取 發酵液經不同極性溶劑依次萃取和直接萃取后，各有機萃取相和萃余相的物質活性用牛津杯法進行檢測，結果見表3。直接用正丁醇萃取的正丁醇相的抑菌活性最好，且在萃余相中活性很弱，因此正丁醇是發酵液中活性物質萃取的最佳溶劑，并通過增加萃取次數來減弱萃余相中的活性物質殘余，提高萃取得率。

2.3.3活性物質純化與結構鑒定 從變形桿菌HA-3151發酵液中分離得到了13個化合物，包括有機酸類3個(D-3-苯基乳酸、丁香酸、3-甲氧基沒食子酸)，二肽類4個[環(丙-苯丙)二肽、環(酪-酪)二肽、環(酪-亮)二肽、環(酪-異亮)二肽]，黃酮類6個(黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、5-甲氧基大豆苷元、染料木黃酮)。各化合物的結構式見圖5，鑒定結果如下：

D-3-苯基乳酸(D-3-phenyllactic acid)，白色結晶；[α]+19.80°；ESI-MSm/z165.056 2[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.23 (m，5H，H-Phe)，4.13 (t，1H，J=3.6 Hz，H-2)，2.95 (d，1H，J=13.6 Hz，H-3a)，2.78 (dd，1H，J=13.6，8.4 Hz，H-3b)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ 40.33 (C-3)，71.25 (C-2)，126.29 (C-7)，128.15(C-5，9)，129.58 (C-6， 8)，138.35 (C-4)，175.34 (COOH)。以上數據與文獻報道的D-3-苯基乳酸數據一致[7-8]。

丁香酸(syringic acid)，無色結晶；ESI-MSm/z197.046 3[M-H]-；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 7.33 (s，2H，H-3，5)，3.88 (s，6H，2OCH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 57.08 (OCH3)，108.65 (C-3，5)，122.20 (C-4)，142.06 (C-2，6)，149.14 (C-1)，170.22 (COOH)。以上數據與文獻報道的丁香酸數據一致[9]。

3-甲氧基沒食子酸(3-methoxygallic acid)，白色結晶；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.07 (s，1H，H-6)，7.02 (s，1H，H-4)，3.77 (s，3H，OCH3)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 56.00 (OCH3)，104.96 (C-6)，110.87 (C-4)，120.67 (C-5)，139.11 (C-2)，145.35 (C-3)，147.93 (C-1)，167.58 (COOH)。以上數據與文獻報道的3-甲氧基沒食子酸數據一致[10]。

環(丙-苯丙)二肽[cyclo (L-Ala-L-Phe)]，無定形粉末；[α]+10.00°；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 7.14-7.26 (m，5H，-Phe)，4.22 (s，1H，H-5)，3.42 (m，1H，H-3)，3.00 (d，1H，J=14.0 Hz，H-8a)，2.64 (d，1H，J=17.6 Hz，H-8b)，0.51 (d，3H，J=6.4 Hz，CH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 21.10 (C-7)，41.56 (C-6)，45.35 (C-8)，58.22 (C-3)，129.16 (C-4)，130.30 (C-11，13)，132.18 (C-10，14)，137.07 (C-9)，169.37 (C-5)，170.73 (C-2)。以上數據與文獻報道的環(丙-苯丙)二肽數據一致[11]。

環(酪-酪)二肽[cyclo (L-Tyr-L-Tyr)]，無定形粉末；[α]+39.39°；ESI-MSm/z327.135 5[M+H]+；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.18 (s，2H，H-1)，7.74 (s，2H，OH)，6.83 (d，4H，J=7.6 Hz，H-2′，2″，6′，6″)，6.66 (d，4H，J=7.6 Hz，H-3′，3″，5′，5″)，3.84 (s，2H，H-3，6)，2.52 (dd，2H，J=13.6，6.0 Hz，H-7，7′a)，2.10 (dd，2H，J=13.6，6.0 Hz，H-7，7′b)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 38.8 (C-7，7′)，56.22 (C-3，6)，115.51 (C-2′，2″，6′，6″)，127.03 (C-4′，4″)，131.22 (C-1′，1″)，156.55 (C-3′，3″，5′，5″)，166.73 (C-2，5)。以上數據與文獻報道的環(酪-酪)二肽數據一致[12]。

表3 不同萃取方法活性對比 mm

注：—表示無抑菌圈。

環(酪-亮)二肽[cyclo (L-Tyr-L-Leu)]，無定形粉末；[α]+10.00°；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 6.93 (d，2H，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.64 (d，2H，J=8.4 Hz，H-14，16)，4.16 (s，2H，H-1，4)，3.69 (dd，1H，J=10.0，4.0 Hz，H-6)，3.13 (dd，1H，J=14.0，4.8 Hz，H-11a)，2.76 (dd，1H，J=14.0，4.8 Hz，H-11b)，1.37 (m，1H，H-8)，0.82 (m，3H，CH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 21.67 (C-10)，23.69 (C-9)，24.98 (C-8)，39.72 (C-11)，45.55 (C-7)，54.42 (C-6)，57.93 (C-3)，116.74 (C-14)，127.33 (C-12)，132.74 (C-13)，133.07 (C-17)，158.49 (C-15)，169.44 (C-2)，170.97 (C-5)。以上數據與文獻報道的環(酪-亮)二肽數據一致[13-14]。

環(酪-異亮)二肽[cyclo (L-Tyr-L-Ile)]，無定形粉末；[α]-32.56°；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 6.93 (d，2H，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.69 (d，2H，J=8.4 Hz，H-14，16)，4.26 (s，2H，H-1，4)，3.70 (dd，1H，J=4.4，1.6 Hz，H-6)，3.19 (dd，1H，J=14.0，4.4 Hz，H-11a)，2.89 (dd，1H，J=14.0，4.4 Hz，H-11b)，0.79～0.67 (m，6H，CH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 12.20 (C-10)，15.66 (C-9)，24.98 (C-8)，39.20 (C-11)，40.14 (C-7)，57.70 (C-5)，61.22 (C-2)，116.59 (C-14，16)，127.80 (C-12)，132.93 (C-13，15)，158.23 (C-15)，169.64 (C-2，5)。以上數據與文獻報道的環(酪-異亮)二肽數據一致[15]。

黃豆黃苷(glycitin)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 8.38 (s，1H，H-2)，7.48 (s，1H，H-5)，7.33 (s，1H，H-8)，7.41 (d，2H，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，6.81 (d，2H，J=7.6 Hz，H-3′，5′)，5.19 (d，1H，J=4.0 Hz，H-1″)，3.46 (m，1H，H-2″)，3.48 (m，1H，H-3″)，3.16 (m，1H，H-4″)，3.46 (m，1H，H-5″)，5.18 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-1″)，5.14 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-2″)，5.41 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-3″)，5.08 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-4″)，4.64 (m，1H，OH-6″)，3.88 (s，3H，CH3)，9.54 (s，1H，OH-4′)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 153.22 (C-2)，123.31 (C-3)，174.56 (C-4)，104.91 (C-5)，147.64 (C-6)，151.72 (C-7)，103.61 (C-8)，151.40 (C-9)，118.00 (C-10)，122.77 (C-1′)，130.25 (C-2′)，115.16 (C-3′)，157.37 (C-4′)，115.16 (C-5′)，130.2 (C-6′)，99.79 (C-1″)，73.20 (C-2″)，76.94 (C-3″)，69.76 (C-4″)，77.39 (C-5″)，60.81 (C-6″)，56.01 (OCH3)。上述數據與文獻報道的黃豆黃苷一致[16]。

大豆苷(daidzin)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.55 (s，1H，OH-4′)，8.39 (s，1H，H-2)，8.05 (d，1H，J=9.2 Hz，H-1)，7.41 (d，2H，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，7.23 (s，1H，H-8)，7.14 (d，1H，J=8.8 Hz，H-6)，6.81 (d，2H，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，5.18 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-1″)，5.14 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-2″)，5.41 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-3″)，5.08 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-4″)，4.64 (m，1H，OH-6″)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 60.82 (C-6″)，69.80 (C-4″)，73.31 (C-2″)，76.66 (C-3″)，77.39 (C-5″)，100.16 (C-8)，103.56 (C-1″)，115.16 (C-3′，5′)，115.76 (C-6)，118.64 (C-10)，122.49 (C-1′)，123.88 (C-3)，127.13 (C-5)，130.26 (C-2′，6′)，153.51 (C-2)，157.21 (C-4′)，157.44 (C-9)，161.58 (C-7)，174.92 (C-4)。以上數據與文獻報道的大豆苷數據[16]一致。

大豆苷元(daidzein)，白色粉末；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 10.77 (s，1H，OH-7)，9.53 (s，1H，OH-4′)，8.27 (s，1H，H-2)，7.95 (d，1H，J=8.4 Hz，H-5)，7.37 (d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.92 (d，1H，J=8.8 Hz，H-6)，6.85 (s，1H，H-8)，6.80 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 102.57 (C-8)，115.42 (C-3′，5′)，115.59 (C-6)，117.10 (C-10)，123.01 (C-3)，123.95 (C-1′)，127.76 (C-5)，130.54 (C-2′，6′)，153.28 (C-2)，157.64 (C-4′)，157.90 (C-9)，162.98 (C-7)，175.16 (C-4)。以上數據與文獻報道的大豆苷元數據[16]一致。

染料木苷(genistin)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 12.93 (s，1H，OH-5)，9.60 (s，1H，OH-4′)，8.42 (s，1H，H-2)，7.39 (d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.81 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.71 (s，1H，H-8)，6.46 (s，1H，H-6)，5.19 (d，1H，J=4.0 Hz，H-1″)，3.46 (m，1H，H-2″)，3.48 (m，1H，H-3″)，3.16 (m，1H，H-4″)，3.46 (m，1H，H-5″)，5.18 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-1″)，5.14 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-2″)，5.41 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-3″)，5.08 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-4″)，4.64 (m，1H，OH-6″)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 60.81 (C-6″)，69.77 (C-4″)，73.26 (C-2″)，76.59 (C-3″)，77.38 (C-5″)，94.71 (C-8)，99.76 (C-1″)，100.02 (C-6)，106.27 (C-10)，115.28 (C-3′，5′)，121.18 (C-1′)，122.74 (C-3)，130.36 (C-2′，6′)，154.79 (C-2)，157.41 (C-4′)，157.69 (C-9)，161.82 (C-5)，163.20 (C-7)，180.70 (C-4)。以上數據與文獻報道的染料木苷數據[16]一致。

5-甲氧基大豆苷元(5-methoxydaidzein)，淡黃色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 10.59 (s，1H，OH-7)，9.52 (s，1H，OH-4′)，8.29 (s，1H，H-2)，7.44 (s，1H，H-5)，7.39 (d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.95 (s，1H，H-8)，6.81 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，3.89 (s，3H，CH3)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 56.01 (OCH3)，103.00 (C-8)，104.89 (C-6)，115.12 (C-3′，5′)，115.13 (C-10)，122.96 (C-3)，123.13 (C-1′)，130.24 (C-2′，6′)，147.11 (C-4′)，151.90 (C-7)，152.68 (C-9)，157.29 (C-5)，174.50 (C-4)。以上數據與文獻報道的5-甲氧基大豆苷元數據一致[17]。

染料木黃酮(genistein)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 12.94 (s，1H，OH-5)，9.57 (s，1H，OH-4′)，8.31(s，1H，H-2)，7.39(d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.81 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.37 (s，1H，OH-8)，6.21 (s，1H，OH-6)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 93.85 (C-8)，99.15 (C-6)，104.64 (C-10)，115.24 (C-3′，5′)，121.39 (C-1′)，122.46 (C-3)，130.34 (C-2′，6′)，154.17 (C-2)，157.60 (C-4′)，157.77 (C-9)，162.18 (C-5)，164.47 (C-5)，180.40 (C-4)。以上數據與文獻報道的染料木黃酮數據[16]一致。

圖5 從普通變形桿菌HA-3151發酵液分離的化合物的結構式

2.4 化合物抗菌活性研究

經微量稀釋法測定各化合物對銅綠假單胞菌的MIC結果見表4；其他化合物無抗菌活性。

表4 單體化合物抗銅綠假單胞菌實驗結果(n=3)

3 結論與討論

本研究從人源腸道菌群中得到1株能產生抗菌活性物質的普通變形桿菌Proteusvulgaris菌株，并從其培養液中分離純化了一系列具有抗菌活性的有機酸、黃酮和二肽類化合物。這是普通變形桿菌代謝產物具有抗菌活性的首次報道，也是腸道菌通過分泌次生代謝產物產生定植優勢進而影響人體的有力證據。

根據我們的實驗結果，結合文獻報道，分離得到的這些代謝產物普遍具有抗菌活性。3-苯基乳酸和丁香酸最早發現于蜂蜜中，是其最主要的抗菌物質[18]。3-苯基乳酸是天然存在的抗菌劑，對人和動物安全無毒，有望作為一種新型防腐劑運用于食品、醫藥及化妝品行業。目前報道3-苯基乳酸主要由乳酸桿菌屬菌株產生，它參與苯丙氨酸代謝途徑。由于乳酸脫氫酶的種類不同，生成的苯基乳酸構型也不相同[19]，D-苯基乳酸的抗菌活性大于L-苯基乳酸[20]，本研究中變形桿菌HA-3151所產生的苯基乳酸即為D型。丁香酸為常見的藥用植物代謝產物，是白蒿的主要抗菌成分，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有抑制作用[21-22]。本研究證明環(丙-苯丙)二肽、環(酪-酪)二肽具有抗菌活性，另有文獻報道環(酪-亮)二肽對犬小孢菌有抑制作用(MIC為50 mg·L-1)[23]，環(酪-異亮)二肽對多種海洋細菌有抑制作用(MIC為200 mg·L-1)[24]。黃酮類化合物的抗菌活性多有報道，本研究中分離得到的大豆苷元、染料木苷和染料木黃酮經檢測有抗菌作用，推測這些成分均為普通變形桿菌的抗菌活性組成成分。

本研究確認了普通變形桿菌通過分泌代謝產物對其他細菌的抑制作用，這證明腸道內確實存在微生物間相互制衡的物質基礎。這些抗菌活性代謝產物被人體吸收后會進入血液循環，對人體其他部位的感染疾病起到干預作用。然而，抗菌活性物質只是腸道菌分泌的代謝產物的一部分，其他代謝產物包括活性物質和毒性物質也同樣會對人體健康產生有利或不利影響。越來越多的研究證實，腸道菌群的紊亂與疾病的發生發展密切相關[25-27]，這是因為紊亂的菌群表現為有益菌減少，有害菌增多。我們認為，菌群的結構改變只是表象，而致病的根源應該歸因于兩者分泌的化學介質的差異。藥物通過調節菌群的結構治療疾病也應該是由于不同的菌群結構釋放的化學介質不同而造成的。因此，開展不同種類的腸道菌的代謝產物研究，應該能為揭秘腸道菌群與人體健康的相關性問題提供科學依據。