青稞酒曲中糖化菌的篩選鑒定及降低青稞淀粉工藝優化

王曉燕，王蓉福，張昊宇，院珍珍,,3，曹效海,3，王樹林,,3*，杜艷

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016) 2(青海省青稞資源綜合利用工程技術研究中心，青海 西寧，810016) 3(青海-甘肅食品研發與檢測聯合實驗室，青海 西寧，810016)

青稞(HordeumvulgareL. var. nudum Hook. f)是禾本科大麥屬作物，主要分布在我國青藏高原地區[1]。作為一種重要的高原谷類作物，青稞中含有豐富的礦物質、氨基酸和維生素[2-3]，此外，青稞中還含有5.25%左右的β-葡聚糖[2]。與其他谷物類作物相比較，青稞具有“三高兩低”(高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖)的特點[3]，具有降血脂及降血糖等功效[4]，這些決定了青稞制品是糖尿病患者優選的優質谷物類食物。

盡管青稞作為糖尿病患者食品具有一定優勢，但青稞中淀粉含量與一般谷物相近[5]，具有高消化率，進入人體會導致血糖迅速升高[6]，此特性限制了青稞在糖尿病專用食品開發方面的應用。通過縮短支鏈淀粉的支鏈長度，增加其支鏈密度，可有效增加淀粉的抗消化性[7]。目前降解淀粉的方法主要有3種：化學法、生物法、生物化學法，并以生物法中的酶法為主流方法[8-10]。而關于利用糖化菌的微生物降解法多運用于谷物類食品深加工及降解甘蔗渣等廢料過程中[11-13]。

微生物法降解淀粉雖具有一定的優勢，但必須具備優質的菌種才可保證其效率[14]。大曲作為釀造青稞酒的糖化劑、發酵劑和生香劑在釀造過程中起著至關重要的作用，其中霉菌是大曲在發酵過程中的糖化菌[15-16]。本試驗以大曲為原料，從大曲中篩選出優勢糖化菌，優化糖化菌降解青稞中淀粉的發酵條件，為采用生物法降解青稞淀粉提供理論依據，從而拓展青稞在糖尿病患者專用食品開發中的應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及試劑

青稞酒大曲：青海青稞酒股份有限公司。

MgSO4，K2HPO4，NaOH，天津市河東區紅巖試劑廠；察式瓊脂培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；3,5-二硝基水楊酸，上海中秦化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

尼康E100型生物顯微鏡，北京佳緣興業科技有限公司；UV-2600型紫外分光光度計，島津企業管理有限公司；WDP-450型電熱恒溫培養箱，上海安亭科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 糖化菌的篩選及鑒定

菌株分離：取青稞酒大曲，參考文獻[17]平板劃線分離直至獲得具有典型形態的霉菌。

霉菌的形態鑒定：根據參考文獻[18]對霉菌進行制片，在顯微鏡下觀察其形態，對霉菌進行鑒定[19]。

糖化菌種的篩選：根據參考文獻[20]，以糖化力為指標，從典型霉菌中篩選最佳糖化菌。在以淀粉為唯一碳源的培養基中加入菌體，28 ℃條件下培養12 h后，測定還原糖質量。霉菌糖化力單位定義為：1 g菌體每小時降解淀粉生成還原糖的質量。

優勢糖化菌的分子生物學鑒定：取斜面菌種送樣。DNA提取、ITS鑒定均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 優勢糖化菌生長性能的測定

根據參考文獻[21]的方法將糖化菌分別接種在霉菌液體培養基中，分別考察溫度(31、34、37、40、43、46 ℃)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、NaCl質量濃度(20、35、50、65、80 g/L)、發酵時間(1、2、3、4、5、6、7 d)對米曲霉生長性能的影響，發酵培養后，計算菌體干重[22]，分析米曲霉的生長性能。

1.2.3 還原糖含量的測定

參考文獻[23]采用DNS法測定青稞發酵液中還原糖的質量，計算單位質量青稞發酵降解成還原糖的質量。繪制標準曲線，其回歸方程為：y=1.078x+0.016 3，R2=0.999 2。

1.2.4 多糖含量的測定

參考文獻[24]，采用苯酚-硫酸法測定發酵液中可溶性總糖的質量，計算單位質量青稞發酵降解成可溶性糖的質量。繪制標準曲線，其回歸方程為：y=7.489 6x-0.028 3，R2=0.998 7。

1.2.5 降低青稞淀粉工藝及操作要點

工藝流程：菌種活化→種子液制備→發酵培養→水洗離心→收集固體→烘干→低糖青稞粉

菌種活化：將保存在-80 ℃的優勢糖化菌菌株在察氏瓊脂培養基上斜面接種，在28 ℃條件下培養3 d，重復2～3次，活化后的菌種保存至4 ℃冰箱待用。

種子液制備：在霉菌液體培養基中接入幾株糖化菌，在28 ℃恒溫振蕩培養箱中擴大培養。

發酵培養：將80目以上的青稞粉與發酵液以料液畢1∶10(g∶mL)的比例在一定條件下發酵培養。

水洗離心：發酵結束后，將發酵液去除，離心得到的固體用蒸餾水洗滌并再次離心，重復2～3次。

烘干：將收集得到的固體放于60 ℃鼓風干燥箱中烘干。

1.2.6 利用糖化菌降解青稞淀粉工藝的單因素試驗

取1 g青稞粉，加入10 mL發酵液，分別考察發酵時間(1、2、3、4、5 d)、發酵初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、發酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)和菌種接種量(3%、6%、9%、12%、15%)對發酵過程的影響，測定發酵液中還原糖及總糖質量分數以確定各單因素適宜的條件。

1.2.7 微生物降解青稞淀粉的響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇對降解青稞淀粉影響較顯著的3個因素，以發酵液中還原糖質量分數為響應值，采用3因素3水平中心組合設計(Box-behnken)[25-26]，對霉菌降解青稞中糖類化合物的發酵工藝進行優化，確定最佳發酵工藝條件。響應面設計因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素及水平表

1.3 數據處理

使用Excel 2010軟件、Spss 20.0軟件和Design-Expert 8.0.6.1軟件進行數據統計分析。試驗結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 分離微生物的菌落形態特征

分離菌株MJ1、MJ2、MJ3經固體培養基培養48 h后菌落形態及特征如表2所示。

表2 不同霉菌菌株的菌落形態及特征

MJ1、MJ2、MJ3經10×光學顯微鏡下觀察，記錄的顯微形態分別如圖1所示。

a-MJ1顯微圖;b- MJ2顯微圖;c- MJ3顯微圖

用光學顯微鏡觀察，3株霉菌形態學特征如表3所示。

表3 不同霉菌菌株的形態學特征

2.2 優勢糖化菌的篩選結果

MJ1、MJ2、MJ3菌株糖化力分別為(58.59±3.98)、(359.62±9.71)、(148.83±3.60)μg/(g·h)，即菌株MJ2糖化力最高且明顯高于MJ1和MJ3，具有明顯降糖優勢。

2.3 優勢糖化菌分子生物學鑒定結果

將獲得的優勢糖化菌ITS基因序列在NCBI上進行blast比對，長度為529 bp。序列比對在99%以上的霉菌為絲衣霉屬(Byssochlamys)，踝節菌屬(Talaromyces)，擬青霉屬(Paecilomyces)，淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)，曲霉屬(Aspergillus)。

結合表2及表3的鑒定結果，并依據其他參考文獻[27]對優勢糖化菌屬種鑒定為：曲霉屬，米曲霉。

2.4 優勢糖化菌生長性能測定

由圖2可知，糖化菌的最適生長溫度在40 ℃左右，此時培養基中出現圓潤的菌絲小球，在40 ℃附近，更適宜米曲霉菌絲體的形成；隨著pH的降低，米曲霉的生長逐漸旺盛，pH為4時，具有最好的生長性能；pH為3時，生長速度稍有下降，表明米曲霉更適宜在酸性條件下生長，米曲霉在過低和過高濃度鈉鹽環境下，生長緩慢，而在3.5%～6.5%條件下，生長良好，一定濃度的鈉離子可以輔助米曲霉的生長，鈉離子濃度過大，不利于霉菌的生長，此結果表明篩選的糖化菌株具有一定的耐鹽性；米曲霉生長曲線如圖2-d所示，可初步判斷0～3 d為米曲霉的生長遲滯期，3～5 d為對數期，6～7 d為穩定期。

圖2 優勢糖化菌生長性能測定

2.5 微生物降解青稞淀粉工藝的單因素試驗結果

發酵結束后，測定發酵液中糖的質量分數是衡量降解青稞淀粉效果的重要指標。由圖3可知，發酵3 d時，糖質量分數最高，發酵過程中糖化作用致使糖質量分數增加，但積累至一定濃度會抑制降解過程，故隨著發酵時間的延長，發酵液中糖的質量分數下降，故選取適宜的發酵時間為3 d；發酵液中糖質量分數隨著起始pH的變化沒有明顯的規律性變化，發酵后發酵液的pH都呈酸性，起始pH為7的條件容易控制，故確定適宜的起始pH為7；溫度為37 ℃時，糖的質量分數最大，溫度過低抑制微生物的生長，過高的溫度則使得微生物生長代謝受阻[26]，從而降解淀粉能力減弱，故選取37 ℃為適宜的發酵溫度；接種量為6%時，糖質量分數最高，接種量過小需要延長發酵時間，接種量過大時，菌體繁殖速度過快，糖化菌生長活力下降，故選取適宜接種量為6%。

圖3 各因素對糖質量分數的影響

2.6 響應面試驗結果

2.6.1 響應面試驗結果及方差分析

響應面試驗結果見表4；回歸模型的方差分析見表5。

表4 響應面設計及結果

用Design-Expert 8.0.6.1 對表4中的試驗數據進行回歸分析，得到試驗因素對還原糖質量分數的多元回歸方程：

表5 二次回歸模型方差分析結果

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01),“*”表示差異顯著(P<0.05)

2.6.2 響應面結果分析

由圖4可知，還原糖質量分數最高時發酵時間應該在2.50～3.50 d之間，發酵溫度應該在36～38 ℃之間，最佳接種量在6%～7%之間。

圖4 因素交互作用對還原糖含量影響的響應面圖

由圖4可以看出，發酵時間對還原糖含量的影響大于發酵溫度和接種量的影響，接種量對還原糖含量的影響大于發酵溫度的影響，即各因素對還原糖含量的影響作用大小為：發酵時間>接種量>發酵溫度，各因素兩者的交互作用對青稞發酵液中還原糖含量的影響都較小。

2.6.3 驗證試驗

對分析所得的最佳條件進行驗證試驗，得到青稞發酵液中還原糖含量為(77.4±4.54)mg/g，分析所得的理論預測值為80.1 mg/g，相對誤差為3.4%，與驗證試驗結果相符，所以基于響應面法所得的糖化菌發酵參數可靠，回歸模擬方程預估發酵液中還原糖質量分數具有可行性。

3 結論

在青稞糖化菌的篩選試驗中，以富含霉菌的大曲為原料，成功篩選出糖化力為(359.62±9.71)μg/(g·h)的優勢糖化菌株，鑒定其為米曲霉。米曲霉的最適生長溫度為40 ℃，最適生長pH為4，對鈉離子具有一定的耐受性，其生長性能良好，具有較好的適應能力。經過發酵降解青稞淀粉工藝優化后，微生物降解青稞中糖類化合物的能力有所提高。在此試驗中，為微生物法降解青稞淀粉提供了良好的菌種，為微生物法降解青稞淀粉提供了技術支持和理論依據。