培養基組成對貝萊斯芽孢桿菌產抑真菌成分的影響

趙鵬鵬，雷淑珍，徐曉光，王蓉，蔣春美，師俊玲

(西北工業大學 生命學院，陜西 西安，710072)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是目前成功用于實際生產的生防菌之一，能夠有效防治由鐮刀菌引起的草莓枯萎病、蘭花枯萎病等農業病害，對稻瘟病菌、鏈格孢菌等病菌也有較強的拮抗活性[1-2]。研究發現，該菌能夠產生蛋白、 多肽、小分子量抗生素等多種抑菌物質，表現出很好的實際應用效果與前景[3]。

根據已有報道，芽孢桿菌代謝合成抑菌物質的種類與產量與培養基組成和發酵條件緊密有關，通過優化培養基組成，可以顯著提高枯草芽孢桿菌發酵產物的抑菌活性[4-5]。亦有報道指出，優化培養基組成能夠促進貝萊斯芽孢桿菌的細胞生長與產物合成[6-8]，但針對性提高其抑菌物質產量的相關研究并不多見。

為獲得高抑菌活性，特別是抑真菌活性的貝萊斯芽孢桿菌發酵產物，本文較為系統地考察了培養基組成對貝萊斯芽孢桿菌所產抑菌物質種類和活性的影響規律，并優化培養條件，以期為生產提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 微生物

貝萊斯芽孢桿菌由本實驗室從土壤中分離獲得，并經分子生物學分類鑒定。

1.1.2 培養基

(1)Landy培養基：葡萄糖20.0 g，L-谷氨酸鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.15 mg，MnSO45.0 mg，CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL，初始pH為7.0。

(2)營養肉湯培養基(NB)：葡萄糖20.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節初始pH為7.0。

(3)營養肉湯瓊脂培養基(NA)：在NB培養基中額外加入20 g/L瓊脂，用于貝萊斯芽孢桿菌的保藏與活化。

(4)馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，用于炭黑曲霉的培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基種類對貝萊斯芽孢桿菌細胞生長和抑菌活性物質產生的影響

Landy培養基被廣泛用于培養芽孢桿菌，NB培養基則是用于培養細菌的常規培養基。分別在這2種培養基(pH 7.0)中接種等量菌種，在32 ℃、160 r/min的條件下培養時間48 h后，離心取菌體，測菌體生物量，以及發酵液的最終pH值和抑菌活性。

1.2.2 培養基組成對抑菌活性物質組成的影響

在Landy培養基中分別加牛肉膏(5 g/L)、NaCl(5 g/L)、蛋白胨(10 g/L)、牛肉膏(5 g/L)+蛋白胨(10 g/L)等NB培養基中營養成分，并以Landy培養基作為對照，在相同條件下培養48 h后，檢測菌體生物量，發酵液pH和和抑菌活性。

1.2.3 培養基組成優化

以NB培養基為基礎，分別改變其中各組分含量，研究NaCl、牛肉膏、蛋白胨、組合氮源、金屬離子和谷氨酸鈉對菌體生長和抑菌活性物質產生的影響。實驗中所用各因素的水平設置如表1所示。

表1 實驗中所用因素與水平

注： 1份離子溶液中含有KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO40.15 mg/L，MnSO45.0 mg/L，CuSO40.16 mg/L

2 結果與分析

2.1 培養基種類對菌體生長與抑菌物質產生的影響

如圖1所示，相對于NB培養基，貝萊斯芽孢桿菌在Landy培養基中的最終pH值和細胞生物量較高，但所得發酵液的抑菌圈直徑卻顯著低于NB培養基。

圖1 培養基種類對發酵液pH、生物量和抑菌活性物質產生的影響

實驗結果說明該菌的細胞生長條件與抑菌物質的產生條件有所不同。相對而言， Landy培養基更有利于貝萊斯芽孢桿菌的菌體生長，而NB培養基則更有利于抑菌活性物質的合成。

2.2 培養基組成對抑菌活性物質組成的影響

如圖2所示，牛肉膏、蛋白胨和NaCl的添加能夠不同程度地降低發酵液的最終pH值和菌體生長量，同時發酵液中殘糖含量較高(4.2 g/L)，說明這些物質抑制了菌體生長。同時NaCl或牛肉膏的添加能夠提高發酵液抑菌活性，但添加蛋白胨和同時添加牛肉膏和蛋白胨反而會降低發酵液抑菌活性。這說明蛋白胨會抑制抑菌物質合成。值得一提的是，即使在Landy培養基中添加與NB培養基中相同濃度的各類物質，發酵液的抑菌活性也達不到NB培養基水平。這說明Landy培養基中一些成分會抑制抑菌物質的合成。

a-Landy培養基；b-Landy培養基+10 g/L蛋白胨；c-Landy培養基+10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏；d-Landy培養基+5 g/L牛肉膏；e-Landy培養基+5 g/L NaCl；f-NB培養基

進一步改變NB培養基中NaCl(圖3)、牛肉膏(圖4)、蛋白胨(圖5)、組合氮源(圖6)的濃度，以及添加金屬離子(圖7)和谷氨酸鈉(圖8)，結果發現，除了在組合氮源實驗中發酵液抑菌活性，隨著牛肉膏添加量增大而降低外，在其他實驗中均呈現，隨著添加物濃度增大先上升后下降的趨勢，并且在NaCl 5 g/L、牛肉膏15 g/L、蛋白胨 10 g/L、金屬離子2 份、谷氨酸鈉5 g/L時，達到最大值。多種氮源組合添加時，以同時添加10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏時所得發酵液的抑菌活性最大。對比不同條件下所得發酵液的最大抑菌圈直徑可以發現：補充谷氨酸鈉和金屬離子能夠大幅度提高發酵液的抑菌活性，然后依次為牛肉膏單一添加組、NaCl添加組、組合氮源組，而蛋白胨添加組的抑菌活性遠低于其他組。說明蛋白胨的添加會抑制抑菌物質的合成。

圖3 NB培養基中NaCl含量對發酵液pH、生物量和發酵液抑菌活性的影響

圖4 NB培養基中牛肉膏含量對發酵液pH、生物量和發酵液抑菌活性的影響

圖5 NB培養基中蛋白胨含量對發酵液pH、生物量和發酵液抑菌活性的影響

進一步分析發現，添加谷氨酸鈉和金屬離子時，對應于最大抑菌圈時的菌體生物量和發酵結束時的pH值也會較高。從而說明，這些指標之間存在一定的相關性。通過優化組合，可得發酵液抑菌活性最高的培養基組成為：每升培養基中含有葡萄糖20 g，NaCl 5 g，牛肉膏15 g，谷氨酸鈉5 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，KCl 1 g，FeSO40.3 mg，MnSO410 mg，CuSO40.32 mg。使用該培養基可使菌體生物量增加90%，60 μL發酵液的抑菌圈直徑可達(23.4±0.47) mm，比抑菌效果較好的NB培養基提高了21.9%。

a-10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏；b-10 g/L蛋白胨和10 g/L牛肉膏;c-10 g/L蛋白胨和15 g/L牛肉膏；d-10 g/L蛋白胨和20 g/L牛肉膏；e-10 g/L蛋白胨和25 g/L牛肉膏

圖7 NB培養基中離子溶液份數對發酵液pH、生物量和發酵液抑菌活性的影響

圖8 NB培養基中谷氨酸鈉含量對發酵液pH、生物量和發酵液抑菌活性的影響

2.3 培養基對發酵液中脂肽類抑菌活性物質抗稀釋濃度的影響

提取不同培養基條件下的發酵液中脂肽物質，冷凍干燥后，配制成不同濃度，檢測其抑菌活性，結果顯如表2和圖9所示。

從表2可以看出：(1)抑菌圈直徑與提取物濃度呈對數正相關。相對而言，低濃度范圍內(2.5～5.0 g/L)的增加幅度較大，高濃度范圍的增幅較小。這可能與溶液在培養基中擴散范圍有限有關。

表2 不同培養基所得脂肽提取物的抑菌活性

圖9 不同培養基中脂肽提取物的抑菌效果擬合曲線

(2)不同培養基所得脂肽提取物在相同濃度下的抑菌活性并不相同。這說明培養基組成不僅影響了抑菌物質的產量，而且改變了抑菌物質的種類與比例。相對而言，添加2份離子和5 g/L谷氨酸鈉所得活性抑菌物質的含量較高。

(3)菌體在Landy培養基中產生的脂肽提取物總量較少，而且所得產物沒有抑菌活性。這與原發酵液有抑菌活性不符。推測菌體在該條件下產生的抑菌物質并非脂肽類物質，而是在脂肽提取條件(pH為2.0)下失去活性的其他物質。

2.4 培養基對抑菌物質種類的影響

HPLC檢測結果顯示(圖10)，貝萊斯芽孢桿菌產生的脂肽物質共有7個峰，其質荷比分別為1 065.79、1 079.91、1 079.96，1 079.95，1 079.92，1 093.98和1 093.98 Da (圖11)。分子量相同，但出峰時間不同的幾個峰可能是其同分異構體。

峰1，m/z=1 065.79；峰2，m/z=1 079.91；峰3，m/z=1 079.96；峰4，m/z=1 079.95；峰5，m/z=1 079.92；峰6，m/z=1 093.98；峰7，m/z為1 093.98

圖11 NB和Landy發酵液中脂肽提取物的物質種類

根據相關研究[5]，m/z=1 065.79 Da 的脂肽可能是 C14 伊枯草菌素 A(Iturin A)的離子加鈉([M+Na]+)或C17 表面活性素(surfactin)離子加氫([M+H]+)。m/z=1 079和1 093 Da的物質是1 065 Da 的同系物，可能分別為C15和C16的 Iturin A6 離子加鈉([M+Na]+)或者surfactin同系物。

對比不同培養基中脂肽提取物的HPLC圖譜可知，Landy培養基所得脂肽物質有7種；除1 079.91和1 079.92外，其他組成含量均低于NB培養基。這可能是導致Landy培養基所得發酵液抑菌活性較低的根本原因。

3 結論

本文研究了培養基組成對貝萊斯芽孢桿菌代謝合成抑真菌活性物質種類和含量的影響，優化得到了抑菌活性物質產量最高的培養基組成。結果表明，適合菌體生長的條件并不適用于活性物質的產生；只有針對抑菌物質的有效合成和活性提高進行條件優化與過程控制，才能有效提高培養物的整體抑菌活性。同時這說明在生產過程中只強調芽孢數量的生產工藝控制并不一定有利于提高產品的整體抑菌活性。本研究所得結果也可為其他芽孢桿菌發酵過程研究提供一定的理論參考和實踐依據。