柑橘果渣發酵產柚苷酶的工藝優化及固定化研究

劉向麗，李僉*，田晶*，費旭，曾超，張楠，王勛

1(大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連，116034) 2(大連工業大學 分析測試中心，遼寧 大連，116034)

柑橘加工過程中會產生近40%的果皮、果渣等廢棄物，除小部分用于動物飼料和果膠等的制備外[1-2]，大部分被丟棄，造成資源浪費和環境污染，因此提高柑橘加工廢棄物的資源化利用水平具有重要的研究意義。王聳等[3]以柑橘加工副產物——柚皮為原料，對棘孢曲霉固態發酵柚苷酶的工藝進行研究，柚苷酶發酵酶活力達到8.19 IU/g干物質，比初始培養基產柚苷酶活力提高7.38 倍，表明可以利用柑橘加工廢棄物為底物發酵生產柚苷酶；而楊穎等[4]采用橘渣水復配培養基發酵生產細菌纖維素(bacterial cellulose, BC)，產量可達10.26 g/L，是不添加橘渣水培養基的2.27 倍，表明利用果渣進行液態發酵具有可行性，并能有效提高產量。將柑橘果渣應用到發酵工藝中是有效降低柚苷酶生產成本的潛在途徑之一，并且對環境保護和資源高效利用具有積極作用。

柚苷酶(naringinase)是一種由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)組成的復合酶[5]，在柑橘類果汁的加工脫苦[6-7]、物質的分離制備、鼠李糖的工業制備、黃酮類物質的工業制備、抗生素的生產等方面具有重要的應用價值。游離狀態的柚苷酶在使用過程中存在操作穩定性差、分離和回收困難等問題[8]，而固定化柚苷酶在應用中可以有效解決上述問題[9]。固定化酶的制備方法主要包括載體固定化法和無載體固定化法，其中無載體固定化法如交聯酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)技術，不需要提供任何載體，且具有催化效率高、操作簡單、成本低廉等優點[10]，是一種具有潛在應用和開發價值的無載體固定化酶技術。武仙山等[11]對交聯酶聚集體技術進行了綜述，就CLEAs的制備、在水溶液中的活性和穩定性、在有機溶劑中的活性和作用機理等方面進行了研究，結果顯示其活性和穩定性可與交聯酶晶體技術相媲美，且操作簡便，更利于研究和應用的普及。

本研究以柑橘果渣浸出液為培養基基質，對實驗室自主保藏的菌種黑曲霉FFCC uv-11進行發酵產酶研究，通過優化培養基組成提高柚苷酶發酵酶活，進一步制備出交聯柚苷酶聚集體，并對其酶學性質進行探究。本研究為柑橘水果資源的深度開發提供了一種有效方式，以達到環境保護和資源高效利用的目的，并可進一步用于研究微生物發酵產酶過程，為生物產業的可持續發展提供基礎數據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株：黑曲霉FFCC uv-11，實驗室自主保藏。

材料：蜜橘，產自江西新余；柚皮苷(≥98%)，寶雞市方晟生物開發有限公司；脫脂豆粉、麩皮粉，大連調味食品廠。其他化學試劑皆為分析純。

儀器設備：PHS-3C pH計，上海比朗儀器制造公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機，上海儀電科學儀器股份公司；Spectrum 10傅里葉紅外光譜儀，美國PerkinElmer；JSM 7800F掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；SpectraMax Plus384酶標儀，美國Molecular Devices(MD)公司。

斜面培養基(g/L)[12]：NaNO33.0，FeSO4·7H2O 0.01，K2HPO4·12H2O 1.0，KH2PO4·2H2O 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，蔗糖30.0，瓊脂30.0，柚皮苷2.0，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

初始發酵培養基(g/L)[12]：KH2PO4·2H2O 1.5，K2HPO4·12H2O 1.5，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO44.0，ZnSO4·7H2O 0.09，CaCl20.1，酵母浸粉2.0，柚皮苷1.5，初始pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢子懸液的制備[12]

將黑曲霉菌種轉接到斜面培養基上，于30 ℃恒溫培養4 d得到成熟的孢子，然后用9 g/L無菌生理鹽水沖洗孢子，倒入裝有玻璃珠和無菌生理鹽水的錐形瓶中，搖勻充分打散孢子，測定孢子懸液的OD600值，并用無菌生理鹽水將其調整至OD600為0.18，即得單孢子懸液，備用。

1.2.2 果渣浸出液的制備

將蜜橘榨汁處理后產生的果渣與去離子水以適當比例混合后在50 ℃水浴中處理2 h，經紗布過濾后得到濾液，即為果渣浸出液，備用。

1.2.3 發酵液的制備

將孢子懸液以體積分數10%的接種量接種至裝液量為30 mL的發酵培養基(250 mL三角瓶)中，在30 ℃，180 r/min的條件下培養5 d。

1.2.4 交聯柚苷酶聚集體的制備[13]

取10 mL 柚苷酶發酵液于試管中，加入2.0 倍體積的叔丁醇溶液，置于4 ℃冰箱中沉淀30 min，接著向試管中加入體積分數為2.0%的戊二醛溶液，混勻后置于4 ℃冰箱中進行交聯處理1.5 h。將反應液在4 000 r/min 條件下離心10 min，移去上清液，并用10 mmol/L pH 4.0 的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液溶液清洗3 遍，最終得到的沉淀物即為交聯柚苷酶聚集體，保存于4 ℃冰箱中,備用。

1.2.5 數據分析

每組實驗均設置3個平行并重復3次，利用Origin 8.5 科學繪圖軟件進行分析和處理。

1.3 測定方法

1.3.1 柚苷酶活性的測定

采用改進的DAVIS法[14]：將0.8 mL的0.8 mg/mL柚皮苷溶液與0.2 mL粗酶液混合均勻，置于50 ℃恒溫水浴中反應30 min。取0.1 mL反應液，加入5 mL一縮二乙二醇(φ=90%)和0.1 mL的NaOH溶液(4 mol/L)，在室溫下靜置10 min，于波長420 nm處測定溶液的吸光值。

柚苷酶活力單位定義[15]：在pH 4.5，溫度為50 ℃的條件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量為1個酶活性單位(U/mL或U/g)。

(1)

酶活回收率/%=

(2)

1.3.2 交聯柚苷酶聚集體的表征

分別用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)和紅外光譜(fourier transform infrared, FTIR)對交聯柚苷酶聚集體進行表征。

2 結果與討論

2.1 渣水比對柚苷酶發酵酶活的影響

由圖1可知，隨著果渣浸出液制備過程中渣水比的提高，柚苷酶的發酵酶活先逐漸增加，在果渣與水比例為1∶8時，柚苷酶酶活達到最大值為430.19 U/mL，是未添加果渣進行發酵時柚苷酶酶活(77.21 U/mL)的5.57倍。而進一步提高渣水比，柚苷酶酶活迅速下降，這與文獻報道的結果相一致。果渣浸出液太濃或太稀均不利于柚苷酶的生產[4]，其原因可能是果渣浸出液濃度太低(即渣水比較高)時，所含營養物質[16]如糖類、氨基酸、微量元素，特別是黃酮類生物活性物質的濃度過低，對菌株生長的促進作用不明顯，進而導致柚苷酶發酵酶活較低；而當果渣浸出液濃度較高(即渣水比較低)時，其中含有抑制黑曲霉uv-11菌株生長或者不利于柚苷酶積累的物質。有研究發現柑橘廢棄物中所含的油脂對酵母和霉菌(例如枯草芽孢桿菌，釀酒酵母，曲霉菌)的生長具有抑制作用[17]，因此選擇合適的渣水比制備果汁浸出液能夠有效提高柚苷酶發酵酶活。

圖1 渣水比對柚苷酶發酵酶活的影響

2.2 果渣浸出液發酵生產柚苷酶的工藝研究

2.2.1 碳源種類對柚苷酶發酵酶活的影響

將黑曲霉FFCC uv-11在以果渣浸出液為基質的培養基上發酵生產柚苷酶，研究不同碳源對柚苷酶發酵酶活的影響，實驗結果如圖2所示，以麩皮粉為碳源時，柚苷酶發酵酶活最高，可達650.37 U/mL，而以可溶性淀粉為碳源時，柚苷酶發酵酶活最低(109.34 U/mL)。麩皮對菌種產酶的影響主要從2方面考慮[18]：一方面是其為產酶提供必要的營養因子；另一方面，其含量增加又會降低培養基的蓬松程度，使通氣量降低，從而影響產酶。且麩皮粉價格便宜，來源廣泛，是柚苷酶發酵的優良碳源。

圖2 碳源種類對柚苷酶發酵酶活的影響

2.2.2 麩皮粉質量濃度對柚苷酶發酵酶活的影響

由圖3可知，當麩皮粉質量濃度在1.5～5.5 g/L范圍內時，隨著麩皮粉濃度的增大，柚苷酶發酵酶活力逐漸提高，當麩皮粉質量濃度為5.5 g/L時，柚苷酶酶發酵酶活達到最高，為892.96 U/mL；而麩皮粉質量濃度繼續增加時，柚苷酶酶發酵酶活逐漸降低。伍玉春等[19]利用黑曲霉SL2K發酵產柚苷酶時，發現當麩皮粉添加量在1%～3%時，隨著麩皮粉添加量的增加，所產柚苷酶酶活力逐漸提高，而當麩皮粉添加量>3%時，柚苷酶酶活力逐漸降低。因此，本實驗確定較優的麩皮粉質量濃度為5.5 g/L。

圖3 麩皮粉質量濃度對柚苷酶發酵酶活力的影響

2.2.3 氮源種類對柚苷酶發酵酶活力的影響

微生物對不同氮源的利用能力不同，而不同種類的氮源對促進微生物生長和產酶的作用也不同，因此發酵過程中應選出合適的氮源種類，防止不適宜的氮源對菌體生長和發酵產酶造成不利的影響[20]。由圖4可知，(NH4)2SO4更利于菌株發酵產酶，此時柚苷酶發酵酶活力(821.56 U/mL)達到最高，而有機氮源中加入酵母浸粉后柚苷酶發酵酶活(641.52 U/mL)較高，與文獻報道一致。劉艷苓等[21]通過不同氮源的比較，最終選定酵母浸膏作為氮源,用于棘孢曲霉JMUdb058發酵產α-L-鼠李糖苷酶，使鼠李糖苷酶發酵酶活比初始培養基的酶活提高了84.67%。

圖4 氮源種類對柚苷酶發酵酶活的影響

2.2.4 不同質量比復合氮源對柚苷酶發酵酶活力的影響

無機氮源成分單一、質量穩定、可被菌體快速利用，而有機氮源中含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸以及少量的生長因子、糖類和脂肪等，使得微生物表現出生長旺盛、菌體濃度增長迅速等特點。因此，文獻也多采用無機氮源和有機氮源復配的方式[20, 22]。由圖5可知，當(NH4)2SO4與酵母浸粉質量比為7∶3時，柚苷酶發酵酶活(1 180.15 U/mL)達到最高，顯著高于單一無機氮源(NH4)2SO4或單一有機氮源酵母浸粉進行發酵時的柚苷酶發酵酶活力。如陳娜等[23]采用(NH4)2SO4與酵母浸粉作為氮源用于黑曲霉發酵產β-葡萄糖苷酶，其發酵酶活力較優化前提高了39.30%。

A-(NH4)2SO4;Y-酵母浸粉

利用果渣浸出液發酵黑曲霉得到的柚苷酶發酵酶活力高達1 180.15 U/mL，是初始條件下柚苷酶發酵酶活力的16.3倍。廉萌等[12]采用黑曲霉FFCC uv-11與根霉FFCC 3201共培養發酵生產柚苷酶，經優化后柚苷酶發酵酶活力可達733.19 U/mL，是未優化的2.22倍；袁文博等[24]通過誘變處理獲得1株高產柚苷酶菌株A.alternateSK.37002，進行培養基優化后柚苷酶發酵酶活力達到624.73 U/mL，發酵酶活力比優化前提高了90%。為提高柚苷酶發酵酶活力和探索柚苷酶發酵生產新工藝提供了思路。

2.3 交聯柚苷酶聚集體的制備及酶學性質研究

2.3.1 交聯柚苷酶聚集體的制備

為了提高柚苷酶的操作穩定性、簡化分離和回收工藝，進一步將發酵所得柚苷酶制備成無載體固定化酶——交聯酶聚集體，研究了不同種類沉淀劑、沉淀劑與發酵液體積比、交聯劑濃度和交聯時間對交聯柚苷酶聚集體制備過程的影響。結果表明，以叔丁醇為沉淀劑，加入體積為2.0倍發酵液體積的叔丁醇對柚苷酶分子進行沉降聚集，然后加入體積分數為2.0% 的戊二醛作為雙功能交聯劑，在4 ℃條件下交聯1.5 h，制備得到交聯柚苷酶聚集體的酶活可達505.21 U/mL，酶活回收率可達73%以上。

2.3.2 交聯柚苷酶聚集體的SEM表征

由圖6交聯柚苷酶聚集體的電鏡掃描結果可知，其表面疏水性高，糖基化程度低，結構致密，呈網狀結構，分子間相互接連，孔徑分布均勻，利于酶分子與相應底物結合，從而推測酶活性表現良好，增加了與酶分子反應的有效面積，提高了酶的利用效率，相比較游離酶而言其溫度酸堿穩定性隨交聯反應而提高。

圖6 交聯柚苷酶聚集體電鏡照片

2.3.3 交聯柚苷酶聚集體的紅外表征

2.3.4 交聯柚苷酶聚集體的酶學性質探究

交聯柚苷酶聚集體與游離柚苷酶水解柚皮苷實驗的最佳反應pH 及pH 穩定性的實驗結果如圖8所示。由圖8-a可知，交聯柚苷酶聚集體的最佳反應pH與游離柚苷酶的最佳反應pH一致，且在相同pH下交聯柚苷酶聚集體相對酶活力更高。而圖8-b表明，游離柚苷酶的相對酶活力隨pH的增加迅速降低，而交聯柚苷酶聚集體的相對酶活力在pH 2.5～8.5范圍內較為穩定，均在85%以上。與朱必玉[13]制備的交聯柚苷酶聚集體相比，本研究的交聯柚苷酶聚集體在pH 3.5～5.5即最佳水解反應條件時，相對酶活力可達99%以上，而在堿性條件下即pH 7.5～8.5時,相對酶活力仍能達到85%左右，比朱必玉[13]的結果提高3倍以上，說明其具有較強的pH 穩定性。

圖7 游離柚苷酶和交聯柚苷酶聚集體紅外光譜圖

a-酶解柚皮苷反應的最適反應pH;b-酶解柚皮苷反應的pH穩定性

交聯柚苷酶聚集體與游離柚苷酶水解柚皮苷實驗的最佳反應溫度及溫度穩定性的實驗結果如圖9所示。由圖9-a可知，交聯柚苷酶聚集體的最佳反應溫度與游離柚苷酶的最佳反應溫度一致，在相同反應溫度下交聯柚苷酶聚集體的相對酶活力更高，這與徐杰等[15]的研究結果一致，并在一定程度上表明交聯柚苷酶聚集體具有優良的溫度穩定性。如圖9-b所示，分別在40～70 ℃保藏6 h后，游離柚苷酶酶活力迅速下降，而交聯柚苷酶聚集體仍能保持較高的酶活性，這與張雙正等[26]采用羧基磁性納米粒子制備雜化磁響應交聯酶聚集體(M-CLEAs)的實驗規律相同。同時，與游離柚苷酶相比，交聯柚苷酶聚集體在 50～70 ℃的熱穩定性均有大幅度提高，這主要是由于酶分子發生交聯之后，分子之間連接更緊密，酶失活需要克服更多的非共價及共價作用力，同時酶分子內部基團的熱振動減小，其發生熱伸展變性的可能性變小，因而提高了其在高溫條件下的穩定性[27]。

a-酶解柚皮苷反應的最適反應溫度;b-酶解柚皮苷反應的溫度穩定性

3 結論

本研究利用柑橘果渣浸出液為培養基基質，對實驗室自主保藏的菌種黑曲霉FFCC uv-11進行發酵產酶研究，通過優化培養基組成提高柚苷酶發酵酶活，進一步制備出無載體固定化酶——交聯柚苷酶聚集體，并對其酶學性質進行探究。結果表明，當果渣與水的比例為1∶8、以5.5 g/L麩皮粉為碳源、(NH4)2SO4與酵母浸粉(質量比為7∶3)為氮源時，柚苷酶發酵酶活可達1 180.15 U/mL，是未優化條件下柚苷酶發酵酶活的15.3倍。進一步以叔丁醇為沉淀劑，戊二醛(φ=2.0%)為雙功能交聯劑，在4 ℃條件下交聯1.5 h，所得交聯柚苷酶聚集體的酶活回收率可達73%以上，且具有良好的pH和溫度穩定性。