同時脫除吡蟲啉和啶蟲脒農殘的虛擬模板表面分子印跡的制備和應用

陳靜鈺，黃鑫，王力，王洪新*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(國家功能食品工程技術研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

茶多酚是茶葉中多羥基酚類化合物的統稱，作為茶葉中具有保健功能的主要化學成分[1-2]，是茶葉深加工的主要產物[3]。隨著歐盟、美國和日本等發達國家對食品及農產品進口的農藥殘留標準的要求日趨嚴格[4]，茶多酚中的農藥殘留也成為了茶葉深加工過程中面臨的主要問題之一，不僅會影響茶多酚產品的質量、損害消費者健康[5]，而且會損害廠家的品牌聲譽，影響我國茶葉深加工產品的出口。

吡蟲啉和啶蟲脒是茶葉種植過程中常用的高效氯煙堿類殺蟲劑[6]，在水和有機溶劑中具有良好的溶解性，因此在茶多酚產品中容易殘留。目前，農藥殘留的去除方法主要有物理法、化學法[7-8]和生物法[9]。其中，化學法和生物法由于安全性的問題[10-11]，并不適用于茶多酚中農藥的去除。在物理方法中，NEZAMADDIN等[12]研究了顆粒狀活性炭對吡蟲啉的吸附性能，發現吸附行為符合Freundlich等溫吸附模型。ZHAO等[13]將花生殼生物炭用于吸附吡蟲啉，吸附量達到6 mg/g，且等溫吸附數據與Langmuir和Freundlich模型高度相關。然而，他們去除農殘的作用并不是特異性的。為了達到最大限度地脫除農殘并最大限度的保留產品的活性成分，探索一種對吡蟲啉和啶蟲脒具有高選擇性的材料十分必要。

分子印跡技術(molecularly imprinted technique, MIT)是一種結合高分子化學、生物化學等學科發展起來的，具備特異性識別功能的新興技術[14-15]。通過MIT人工合成的具有高穩定性、高選擇性等特點的功能性識別材料被稱為分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)。迄今為止，MIP已在許多研究中被用于去除有害物質。例如，SNCHEZ-POLO[16]成功地合成了能夠從水中脫除四環素的MIP。同樣地，一種用于吸附釷(Th，IV)的分子印跡固相萃取材料也被研究出來[17]。在吡蟲啉和啶蟲脒的分子印跡研究方面，FAROOQ等[18]合成了用于檢測蘋果汁中吡蟲啉的磁性表面分子印跡材料，材料對樣品的回收率為77.66%～96.57%，顯示了良好的分析性能。KUMAR等[19]將合成的磁性分子印跡材料應用于分離蜂蜜和蔬菜樣品中的吡蟲啉，在茄子和蜂蜜樣品中對吡蟲啉的回收率達到(87.1±5.0)%和(90.6±5.6)%。對于啶蟲脒的分子印跡材料則多見應用于電化學傳感器[20]。然而，這些研究都以檢測為目的進行材料的制備和性能研究；其次，目前還沒有應用MIP同時吸附吡蟲啉和啶蟲脒的研究。虛擬模板分子印跡是一種能夠有效避免模板泄漏的技術[21-22]，在實際樣品應用中，模板泄漏會在分離過程中造成嚴重的污染。煙酰胺是吡蟲啉和啶蟲脒的結構類似物，具有抗炎作用，常作為食品添加劑、化妝品以及藥物使用，被廣泛認為安全性較高[23]。選擇煙酰胺作為虛擬模板，不僅可以同時對吡蟲啉和啶蟲脒進行脫除，還能避免模板泄漏造成的農藥污染，提高材料的安全性。本研究以低毒的煙酰胺作為虛擬模板分子，采用分子印跡技術制備了基于硅膠的虛擬模板表面分子印跡聚合物(dummy template surface molecularly imprinted polymers, DMIP)，并對材料進行優化，通過吸附實驗考察了其吸附能力，最終成功地應用于去除茶多酚溶液中的吡蟲啉和啶蟲脒，為茶提取物中農藥殘留的脫除提供了一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡蟲啉、啶蟲脒、煙酰胺標準品，阿拉丁試劑公司；茶多酚，遵義陸圣康源科技有限公司；乙腈(色譜純)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，上海泰坦科技股份有限公司；甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈(分析純)，阿拉丁試劑公司；冰醋酸、甲苯、無水Na2SO4、福林酚、Na2CO3、沒食子酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Su1510型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Waters Quattro Premier XE質譜儀，美國沃特世公司；YQ型超聲波清洗機，上海易凈超聲波儀器有限公司；HH-4型數顯攪拌水浴鍋，常州賽普實驗儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 改性硅膠的合成

改性硅膠的合成根據已有的文獻[24]進行了一定的改進。將4 g硅膠浸入100 mL的10 mol/L HCl溶液中攪拌24 h，過濾后用去離子水洗滌至中性并干燥。將干燥后的硅膠與50 mL甲苯混合，逐滴滴加6 mL APTS和適量吡啶，在氮氣保護下攪拌20 min。將反應體系控制在373 K，回流24 h，然后用甲苯、丙酮、乙醚、甲醇對所得混合物進行洗滌，最后在真空烘箱中干燥8 h，制備得到氨基改性硅膠。

將4 g氨基改性硅膠與50 mL甲苯混合，在氮氣保護下加入8 mL丙烯酰氯，磁力攪拌10 min后逐滴滴加適量的三乙胺，然后在室溫下攪拌24 h。所得化合物經甲苯、丙酮、乙醚和甲醇過濾洗滌后，在真空烘箱中干燥8 h，制備得到酰基改性硅膠。

1.3.2 分子印跡的合成

稱取123.4 mg(約1 mmoL)煙酰胺置于250 mL圓底燒瓶中，以 80 mL不同比例甲醇-水混合溶解。然后加入適量酰基改性硅膠與0.34 mL MAA(4 mmol)并超聲30 min，待充分溶解分散后避光放置4 h，使模板分子與功能單體充分作用。將適量EGDMA和AIBN(40 mg)加入到該混合物中，通高純氮氣20 min，使得瓶內保持惰性氛圍，在氮氣保護下將燒瓶密封，在333 K水浴下熱引發聚合24 h。以V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1為溶劑，通過索氏提取法除去模板。所得材料以甲醇洗滌至中性，在323 K下真空干燥6 h，制備得到DMIP。作為對照，在相同條件下不添加模板分子制備了非印跡聚合物(DNIP)。

1.3.3 虛擬模板表面分子印跡制備條件的優化

1.3.3.1 單因素優化實驗

考察交聯劑和功能單體用量的摩爾比、酰基硅膠的用量以及溶劑的配比3個因素對DMIP印跡效果的影響，得到單因素的最佳制備條件。

準確稱取10 mg制備得到的DMIP和DNIP并分別置于25 mL錐形瓶中，然后分別加入8 mL質量濃度為0.2 mg/mL的吡蟲啉和0.2 mg/mL啶蟲脒混合水溶液。在室溫下搖晃20 h后，離心取上清液，并用去離子水稀釋至4 mL。采用HPLC-MS-MS法測定上清液中的吡蟲啉和啶蟲脒的濃度，計算吸附容量Q(mg/g)和特異因子α，計算方法如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：ρ0，初始質量濃度，g/mL；ρt，平衡質量濃度，g/mL；V，溶液體積，mL；m，材料質量，mg。Qm，DMIP的吸附容量，mg/g；Qn，DNIP的吸附容量，mg/g。

最終的QDMIP為 DMIP對吡蟲啉和啶蟲脒吸附容量的平均值。

1.3.3.2 分子印跡聚合物制備條件響應面優化實驗

根據單因素優化實驗的結果，以交聯劑和功能單體用量的摩爾比(A)、酰基硅膠的用量(B)、溶劑的配比(C)為實驗因素，以虛擬模板表面分子印跡的吸附容量QDMIP(mg/g)和特異因子α為響應值，利用軟件Design-Expert對實驗結果進行分析。

1.3.4 分子印跡的掃描電鏡表征

稱取DMIP和DNIP粉末適量，粘于導電膠上并鍍金，用掃描電鏡觀察樣品形態。

1.3.5 分子印跡的吸附性能研究

準確稱取200 mg的DMIP和DNIP分別置于250 mL錐形瓶中，然后分別加入50 mL的0.2 mg/mL吡蟲啉和0.2 mg/mL啶蟲脒混合水溶液。在室溫下搖動5、30、90、150、210、270、330和390 min后，取0.15 mL混合溶液離心并取上清液，用去離子水稀釋至4 mL。采用HPLC-MS-MS法測定上清液中吡蟲啉和啶蟲脒的濃度，計算吸附容量。

1.3.6 分子印跡應用于脫除茶多酚中的吡蟲啉和啶蟲脒

將100 mg DMIP通過濕法裝柱填充到固相萃取柱中，加入10 mL甲醇進行活化備用。將50 mL的20 mg/mL茶多酚溶液中添加10 μg/mL吡蟲啉和啶蟲脒，作為上樣液進行固相萃取，樣液的流速控制在1.25 mL/min。之后，用10 mL去離子水洗去弱保留化合物，合并洗脫液，用HPLC-MS-MS測定洗脫液中茶多酚、吡蟲啉和啶蟲脒的濃度。

2 結果與討論

2.1 虛擬模板表面分子印跡制備條件的優化

2.1.1 交聯劑和功能單體用量的摩爾比對分子印跡材料印跡效果的影響

交聯劑和功能單體用量的摩爾比能夠影響分子特異性吸附位點的數量，從而影響其吸附效果。將QDMIP和α作為指標，對交聯劑和功能單體用量的摩爾比對分子印跡效果的影響進行考察，結果如表1所示。

表1 交聯劑和功能單體用量的摩爾比對分子印跡效果的影響

由結果可知，若要QDMIP和α達到最優的條件，交聯劑與功能單體用量的摩爾比為7∶1。這可能是因為在交聯劑的添加量較少時，分子印跡聚合物的交聯度較低，以至于不能夠充分固定功能單體和模板分子，難以形成足夠的排列有序的空間位點；而當交聯劑的添加量太多時，分子印跡聚合物的交聯度較高，單位質量的聚合物中產生的特異性識別孔穴較少，因此也會對材料的印跡效果造成影響。

2.1.2 酰基硅膠的用量對分子印跡材料印跡效果的影響

改性硅膠的用量會對分子印跡聚合物的吸附效果產生很大的影響。若改性硅膠的用量過少，則會導致有一部分的模板分子和功能單體不能在改性硅膠的表面聚合，從而使得印跡層的厚度較大，影響特異性吸附效果；當改性硅膠的用量過多時，不僅會導致硅膠顆粒發生團聚，而且會使得硅膠表面的印跡層過薄，從而使得單位質量聚合物中的有效印跡位點減少。將QDMIP和α作為指標，對酰基硅膠的用量對分子印跡效果的影響進行考察，結果如表2所示。實驗結果顯示，酰基改性硅膠的最佳用量是0.9 g，此時QDMIP和α達到最優。

表2 酰基硅膠的用量對分子印跡效果的影響

2.1.3 溶劑的配比對分子印跡材料印跡效果的影響

含水體系的極性溶劑可以有效地增加分子印跡聚合物在水相中的識別性能。將QDMIP和α作為指標，對溶劑中甲醇和水的配比對分子印跡效果的影響進行考察，結果如表3所示。

表3 溶劑的配比對分子印跡效果的影響

結果顯示，當溶劑中甲醇與水的配比為90∶10時，QDMIP和α達到最優。這可能是因為添加適量的水可以增加MAA與模板分子靜電和疏水作用，從而增強其在水相中的特異性識別能力；然而當溶劑中水的含量過多時，則會嚴重干擾模板分子和功能單體之間氫鍵的形成。

2.1.4 響應面試驗設計及結果

虛擬模板表面分子印跡制備優化的響應面分析結果見表4。采用Design-Expert對實驗結果進行回歸分析，方差分析的結果見表5及表6。

表4 響應面試驗設計及結果

結合2個回歸模型方程，采用Design-Expert 8.0繪制了響應面分析圖，見圖1。結果表明，交聯劑與功能單體用量比和酰基硅膠用量、改性硅膠用量和溶劑配比3個因素互相的交互作用都會對DMIP的吸附容量QDMIP以及選擇因子α產生明顯的影響。結合2個模型，通過軟件分析，最終得到DMIP的最佳制備條件為：交聯劑和功能單體用量的摩爾7.05∶1，改性硅膠用量0.919 mg, 溶劑中甲醇/水的體積比為90.13∶9.87。

表5 回歸模型各項方差分析(QDMIP為響應值)

表6 回歸模型各項方差分析(α為響應值)

2.2 分子印跡的掃描電鏡表征

圖2為DMIP和DNIP的掃描電鏡圖像。將圖2-a、圖2-b與圖2-c、圖2-d相比，可以明顯看出DMIP呈現網絡狀的分支結構，與DNIP相比更加的疏松多孔，且有明顯的結塊現象。這是由于DMIP在制備的過程中加入了煙酰胺作為虛擬模板分子，模板分子被洗脫之后留下了與對應結構互補的空間結構，這些空間結構使得DMIP看起來更加粗糙蓬松。在DNIP表面鑲嵌有硅膠顆粒，這也說明材料的聚合過程是在硅膠的表面進行的。

2.3 分子印跡的吸附性能研究

如圖3所示，DMIP和DNIP對吡蟲啉和啶蟲脒的吸附量皆隨著吸附時間的增加而增加。在前90 min，DMIP和DNIP對吡蟲啉和啶蟲脒的吸附速率較快，在210 min之后基本達到吸附平衡，說明該表面印跡材料對吡蟲啉和啶蟲脒具有較大的吸附動力學。這是由于所制備的表面分子印跡的吸附位點基本位于材料表面，在吸附過程中能夠更加快速高效地和底物接觸。與此同時可以發現，雖然具有相似的吸附趨勢，但是DMIP吡蟲啉和啶蟲脒的吸附量比DNIP大得多，這是由于虛擬模板分子在DMIP表面上產生了特異性吸附位點，使得吡蟲啉和啶蟲脒更容易進入。

圖1 各因素的交互作用對QDMIP和α的響應面分析圖

放大倍數(a，c)15 000，(b，d)5 000

a-吡蟲啉;b-啶蟲脒

2.4 分子印跡脫除茶多酚中的吡蟲啉和啶蟲脒

將所制備的DMIP材料用于從茶多酚中去除吡蟲啉和啶蟲脒。將50 mL上樣溶液經過DMIP柱，再用10 mL去離子水過柱，合并流出液。采用高效液相色譜-質譜聯用儀(HPLC-MS-MS)和紫外可見分光光度計(UV-visible)分別測定了2種農藥和茶多酚的含量。結果表明，經過DMIP柱后，上樣液中吡蟲啉和啶蟲脒的濃度均顯著下降。通過3個平行實驗測定可知，該柱對吡蟲啉和啶蟲脒的去除率分別為96.2%和95.6%，而對茶多酚的吸附率僅為3.7%，遠低于2種農藥的吸附率。結果表明，DMIP材料對茶多酚溶液中的吡蟲啉和啶蟲脒具有選擇性吸附能力，有望應用于在茶多酚生產工藝中去除殘留的吡蟲啉和啶蟲脒。

3 結論

本實驗以硅膠為基底、煙酰胺為虛擬模板分子，采用表面印跡法制備了能夠特異性吸附吡蟲啉和啶蟲脒的表面分子印跡聚合物。選用無毒的煙酰胺作為虛擬模板，不僅避免模板滲漏和污染，而且可以為吡蟲啉和啶蟲脒提供吸附位點。通過單因素實驗，采用響應面分析法對DMIP的制備條件進行優化，得到DMIP的最佳制備條件為：交聯劑和功能單體用量的摩爾比為7.05∶1，改性硅膠用量0.919 mg, 溶劑中甲醇/水的體積比90.13∶9.87，并且對優化后DMIP的吸附性能進行評價。結果表明，優化后的DMIP對吡蟲啉和啶蟲脒具有良好的吸附性能和選擇性，對吡蟲啉和啶蟲脒的最大吸附量分別為41.73和21.95 mg/g，與其他種類的分子印跡材料相比具有一定的優勢[18-19]，適合作為吸附材料使用。此外，該聚合物還成功地作為柱填料同時去除茶多酚中的吡蟲啉和啶蟲脒，對吡蟲啉和啶蟲脒的脫除率分別達到96.2%和95.6%，對茶多酚的吸附率僅為3.7%。因此，該材料有望用于茶提取物中吡蟲啉和啶蟲脒的脫除中，可以進一步研究DMIP的結構穩定性及重復利用性，以期更好地用于工業化生產。