頂溫對特香型大曲理化指標及菌群演替的影響

陳可丹，吳曉江，陳延儒，劉婷，萬茵，劉成梅，吳酬飛，付桂明*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047) 2(南昌大學 食品學院，江西 南昌，330047)3(湖州師范學院 生命科學學院，浙江 湖州，313000)

大曲作為主要糖化發酵劑，被譽為酒之母、酒之骨、酒之魂，在白酒釀造過程中起著至關重要的作用[1]。各大名優白酒企業均利用環境微生物自然接種發酵制備大曲，其產區獨特的地理氣候環境決定了曲塊上生長的微生物種類和比例，這些微生物在發酵過程中可通過代謝產生不同揮發性香味成分，從而形成不同的白酒香型。傳統大曲制作工藝通常通過室溫、水分、通風等環境因素來調節曲溫，因此微生物受環境因素影響大，導致大曲發酵過程不穩定，質量不一致，成為制約中國白酒標準化生產的關鍵難題[2]。

其中，溫度是影響大曲理化指標及微生物多樣性的重要因素[3]。根據制作頂溫的不同，大曲可分為高溫(>60 ℃)、中溫(50～60 ℃)和低溫大曲(<50 ℃)[4]。研究發現，大曲發酵溫度和制作工藝不同，可造成中、低、高溫大曲之間糖化力、液化力、酯化力、發酵力相差很大[5]。劉延波等[6]對中、高溫大曲進行高通量測序，研究發現高溫曲中的細菌與中溫曲相比，Bacillus(芽孢桿菌屬)和Thermoactinomyces(高溫放線菌屬)顯著上升，而Kroppenstedtia和Lactobacillus(乳桿菌屬)顯著下降。

特香型白酒是江西省獨有的名優白酒，風味特點是“濃頭醬尾清中間、三香俱備猶不靠”，采用中高溫大曲進行釀造，其頂點溫度一般在55 ℃左右。特香型大曲生產工藝是以面粉、麥麩為主要原料，其獨特之處是添加一定比例的酒糟(15～20%)以提高大曲的酸度及透氣性，從而利于耐酸性微生物的生長[7]，另外本文高頂溫曲加入了豌豆粉，以提高大曲風味層次并防止品溫過高導致大曲開裂。目前關于特香型白酒大曲的研究，多集中于大曲理化指標及采用可培養手段對大曲的菌落進行分析，但未見不同頂溫對特香型大曲的理化指標及微生物演替的影響報道。因此，本文通過以特香型白酒大曲為研究對象，測定其發酵過程中理化指標及菌群演替的變化規律，揭示頂溫對大曲制作過程中理化指標及菌群演替的影響，為提高特香型白酒大曲的質量提供理論研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：實驗所用大曲為江西酒廠在相同環境制作的中頂溫曲(BM)及高頂溫曲(BH)，曲醅規格28 cm×16 cm×7 cm，重量約3.4 kg。

試劑：NaOH、H2SO4、HCl、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、乙酸鈉、I2、KI、可溶性淀粉、三氯乙酸、Na2CO3(分析純)，國藥集團化學試劑公司；福林酚(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

分析電子天平(FA2004)，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；pH計(FE 28)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；紫外-可見光分光光度計(SP-756P)，上海光譜儀器有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集及處理

在每個曲房的中心和兩側取等量樣品，粉碎并混合均勻于4 ℃保藏，部分于-80 ℃保藏用于菌落分析。

1.3.2 大曲理化指標及水解酶系測定

定期用溫度計測定大曲品溫及室溫。參照QB/T4 257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[8]，采用常壓干燥法、電位滴定法分別測定大曲的水分含量及酸度。采用DNS比色法測定大曲中還原糖含量[9]。參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定酸性蛋白酶酶活力[10]。通過DNS法測定還原糖含量間接計算糖化酶活力[11]。參照沈怡方《白酒生產技術全書》測定酯化力[12]。

1.3.3 大曲菌群結構分析

將大曲樣品送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序，并進行物種注釋及豐度等分析。

2 結果與分析

2.1 大曲固態發酵過程中溫度及水分含量的變化

兩批大曲的溫度變化均為前期逐漸上升達到最高品溫，后期緩慢下降至室溫的過程，并且室溫的變化曲線與品溫一致(圖1)。BM發酵前期升溫速率高于BH，于7 d達到頂溫58 ℃，而BH于8 d達到頂溫62 ℃。研究表明大曲前期溫度上升可能是由于可溶性糖被微生物大量利用，從而大量產熱所致[13]。而大曲溫度逐漸達到頂溫后，導致大曲中部分不耐熱微生物生長受到抑制甚至死亡，使大曲菌群結構發生變化[14]。

水分含量變化均隨時間的延長而下降，初始含水量在45%左右，最終含水量均保持在11%左右(圖2)。發酵過程中由于微生物大量繁殖產熱，曲房溫度升高，尤其在頂溫區，水分被大量蒸發，造成其含量急劇降低。研究表明出房時較低的水分含量有利于降低微生物的生長代謝，使得大曲易于保存[15]。同時，大曲中微生物產熱能力下降，導致品溫降低，發酵后期大曲的品溫與室溫基本一致。

a- BH;b- BM

a- BH;b- BM

2.2 Illumina MiSeq測序分析大曲固態發酵過程中微生物群落結構演變

根據OTU劃分和分類地位鑒定結果，選取在屬分類水平上最大相對豐度排名前20的屬，生成物種相對豐度分布柱形圖，如圖3所示，結果顯示2批大曲固態發酵過程中菌群呈現明顯動態演變。

a-真菌屬；b-細菌屬

如圖3-a所示，在BH發酵過程中，嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)和假絲酵母屬(Candida)為大曲發酵過程的優勢菌。Candida與乙酸發酵密切相關，且在釀造中可產生乙酸乙酯等香味物質，其在BH和BM發酵前期為絕對優勢菌；但后期其相對豐度均大幅下降，可能與水分或營養物質含量下降，菌絲自溶有關[16]。Thermoascus是釀酒環境的重要酶源產生菌，可促進多糖和蛋白質的降解，有利于大曲產酒生香[17]，其在BH和BM發酵過程中相對豐度呈先下降、經頂溫區后上升的趨勢，發酵后期成為優勢菌。Diutina為BH發酵前期優勢菌，隨溫度升高生長受到抑制，可能其為不耐熱菌。嗜熱真菌屬(Thermomyces)為BH和BM發酵后期優勢菌，出現于頂溫區后，BM中其相對豐度高于BH。曲霉屬(Aspergillus)能產生多種蛋白酶及其他分解酶類，對大曲糖化力和生香作用均有影響，在BH發酵末期相對豐度低于BM，可能由于BH發酵過程的頂溫超過Aspergillus所耐受最高溫度。

從圖3-b中可知，糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、放線多孢菌屬(Actinopolyspora)和腸桿菌(Enterobacter)是BH和BM發酵中的優勢菌。Saccharopolyspora能產生酶類和纖維素降解促進因子，是安全的生物資源菌[18]，其在BM中的相對豐度高于BH，BM發酵中其相對豐度在中期上升之后下降；BH發酵過程中其在22 d成為絕對優勢菌而后下降。Lactobacillus、Weissella、Pediococcus作為乳酸菌，被認為是白酒發酵過程中重要的產風味菌屬，可代謝產生乳酸、乙酸等有機酸，為白酒中風味物質的形成提供前體[19]。Weissella在BM發酵前期的相對豐度高于BH。在1～4 d時，BM發酵過程中Pediococcus的相對豐度明顯升高，而在BH中其相對豐度僅為1.1～3.6%。進入頂溫區之后，Weissella和Pediococcus受熱失活，因此相對豐度有一定的降低。Lactobacillus在BH中相對豐度遠高于BM。由于乳酸菌具有一定耐熱性，在進入頂溫區之后，其失活速度低于其他不耐熱菌，因此在BH中其相對豐度仍高于BM。同時Enterobacter在BH中相對豐度低于BM，且經過頂溫區后均下降，這與Enterobacter耐高溫性能較低有關。

2.3 大曲固態發酵過程中酸度及還原糖的變化

如圖4所示，BH的酸度在發酵前2 d迅速上升，可能是由于產酸細菌(如Lactobacillus)代謝旺盛(圖3-b)[20]。初始酸度BH高于BM，但BH的酸度下降緩慢，說明起始產酸微生物具有一定的耐熱性。而BM的酸度下降迅速，可能是由于前期溫度上升至超過產酸細菌的耐熱溫度，與Weissella、Lactobacillus、Pediococcus相對豐度的變化相符(圖3)。然而，在發酵7～24 d BH的酸度要高于BM，可能是由于發酵中期較高品溫抑制其他微生物生長，且耐熱芽孢桿菌(Bacillus)僅在BH此階段出現，可代謝產生有機酸。后期酸度的下降可能是由于有機酸降解或與醇反應生成酯類等。

a- BH;b- BM

a- BH;b- BM

大曲中還原糖含量均處于動態變化的過程(圖5)，可能是因為微生物生長以還原糖作為營養物質的同時，代謝產淀粉酶、糖化酶降解原料中的淀粉等物質生成還原糖[21]。初始還原糖含量BH低于BM，且BH在發酵前8 d呈上升趨勢，可能是由于僅在BH原料中添加的豌豆粉含有豐富的糖化酶，且從圖5可知BH糖化酶活力在4～6 d上升，同時其還原糖含量再次急劇升高。而BM還原糖含量呈下降趨勢，可能是由于溫度迅速上升，糖化酶活力下降，微生物的消耗速率大于其降解產還原糖的速率。進入頂溫區后，BH和BM的還原糖含量急劇下降，可能是糖化酶活力均處于較低水平及微生物生長大量消耗。

2.4 大曲固態發酵過程中酸性蛋白酶活力、糖化力及酯化力的變化

白酒發酵在酸性環境下進行，許多香味物質來自蛋白質的分解產物及美拉德反應，所以酸性蛋白酶對白酒風味的形成具有直接影響[15]。如圖6-a、6-b所示，BH酸性蛋白酶活性在1～4 d上升，而BM酸性蛋白酶活力只在1～2 d上升，且BM下降速率要高于BH。這可能是由于大曲發酵前期BH和BM中Lactobacillus和Weissella的豐度均較高(圖3-b)，產酸能力較高，故保持較高酶活。但隨著大曲發酵，產酸細菌逐漸減少，BM中變化尤為明顯，從而造成BM中酶活更快地下降。經過頂溫區后，大部分微生物生長受到抑制，BH和BM的酸性蛋白酶活力趨于平穩。Aspergillusniger、Monascus和Aspergillusoryzae是代謝產酸性蛋白酶的重要微生物[22]。出房時BM和BH的蛋白酶活力分別控制在33和23 U/g，且BM中Aspergillus的豐度明顯高于BH。這些結果說明Aspergillus可能是導致BM發酵后期酸性蛋白酶活性更高的原因。

a- BH;b- BM;c- BH;d- BM;e- BH;f- BM

大曲中糖化力的變化是由小麥本身糖化酶活力的破壞和微生物糖化酶的生成共同作用[23]。如圖6-c, 6-d所示，大曲起始較高的糖化酶活力主要來自于大曲原料小麥等，之后在發酵過程被破壞，失活程度大于微生物代謝生成量。BH糖化力在3～6 d急劇上升，可能是由于此階段還未到高溫期，且大曲原料中的淀粉不能被大多數酵母和細菌直接利用，因此需通過絲狀真菌產生的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶將其水解為可發酵的糖[24]，如Monascus在BH此發酵階段相對豐度從0.1%上升至0.5%，其作為糖化菌能利用各種糖類。BM由于前期溫度上升較快及微生物的消耗，糖化酶活力下降，BM在7～15 d高品溫區后糖化酶活力下降緩慢，而BH經過8～16 d高品溫區后糖化酶活力下降較多，可能由于高品溫使霉菌生長代謝受到抑制，產糖化酶的量減少，且糖化酶活性的耐熱性不強[25]，活力受到抑制。有研究表明，根毛霉(Rhizomucor)和Aspergillus是大曲中淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶的主要生產者[21]。而Rhizomucor和Aspergillus在BM中相對豐度高于BH(圖3)，因此造成BM發酵后期糖化力高于BH的現象。且BM在發酵后期，還原糖含量有明顯的上升，可能與其糖化力較高有關。

酯化力是反應大曲生香能力的重要指標，是指酸和醇結合，脫去1個水分子形成酯的能力[26]。酯化力主要由大曲中霉菌、酵母生成，發酵前期它們大量生長繁殖并啟動代謝酯化酶[27]，從圖6可知，BH和BM在高品溫區時，代謝酯化酶達到高峰并催化酯化反應，促進香味物質的積累。研究發現Candida在醬香型大曲中不僅具有醇類發酵的作用，且其豐度也與酯酶的含量呈正相關[28]。Candida是BM和BH發酵前期優勢真菌，對特香型大曲的酯化力可產生較大影響。經過高品溫區后，隨著Candida豐度下降，大曲的酯化力下降。同樣，有研究表明，Rhizomucor和Thermomyces在不同大曲中對酯類物質的增加具有重要的作用[2, 28]。而圖6-e、6-f顯示出房時BM酯化力高于BH，這可能是由于發酵后期BM中Rhizomucor和Thermomyces的相對豐度高于BH(圖3-a)。

3 結論

大曲在白酒釀造中具有提供微生物來源，糖化發酵、投糧及生香作用。品溫被認為是評估大曲固態發酵過程的關鍵環境變量之一。Illumina MiSeq測序結果表明，2批大曲發酵過程中優勢菌相似但動態變化存在明顯差異。同時發現由于頂溫的不同，大曲理化指標的變化趨勢也存在部分差異。該文通過研究不同頂溫對大曲微生物群落及理化指標的影響，有利于酒曲功能微生物的篩選與其在特香型白酒中的高效利用，對提高酒曲生產質量及特香型白酒的釀造控制具有良好的理論指導，在一定程度上推動特香型白酒行業的發展。