復方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能的效果及其機制

林深常 李運景 趙偉國

摘要 目的：探討復方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能的效果及其機制。方法：將SPF級雄性SD大鼠40只隨機分為觀察組和對照組，每組20只。觀察組采用L-羥脯氨酸注射法誘導創立腎草酸鈣結石大鼠模型，并以復方廣金錢草合劑灌胃干預28 d。分別于對照組入組后和觀察組建模前、建模后1 d、建模后28 d收集尿液標本，進行尿量、尿蛋白、尿肌酐、尿鈣等腎功能相關指標的檢測。并在收集尿液標本的同時取2組尾靜脈血2 mL，進行血肌酐、血尿素氮等腎功能指標的檢測。觀察組干預28 d均雙腎標本，其中左腎制成10%勻漿進行丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平檢測，右腎組織切片并通過免疫組織化學檢測骨橋蛋白（OPN）和轉化生長因子-β（TGF-β）等炎性相關蛋白表達情況。結果：與對照組比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與同組建模前比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與同組建模后1 d比較，觀察組建模后28 d尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組比較，觀察組腎組織MDA水平以及OPN、TGF-β陽性表達率升高，SOD、GSH-Px水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：復方廣金錢草合劑可改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能，而改善氧化應激和炎性反應可能為其作用機制。

關鍵詞 復方廣金錢草合劑;腎結石;草酸鈣;大鼠;腎功能;氧化應激;炎性反應

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of Compound Herba Desmodii Mixture on renal function in rats with calcium oxalate calculi.Methods：A total of 40 male SPF SD rats were randomly divided into a study group and a control group， with 20 rats in each group.The model of calcium oxalate nephrolithiasis was induced by L-hydroxyproline injecting in the study group.The rats were treated with Compound Herba Desmodii Mixture for 28 days.Urine samples were collected from the control group and study group before modeling， 1 day after modeling and 28 days after modeling.The urine volume， urinary protein， urinary creatinine and urinary calcium were detected.At the same time of urine samples taking， 2 mL of caudal vein blood were collected from the 2 groups.Serum creatinine， blood urea nitrogen and other renal function indexes were detected.The left kidney was made into 10% homogenate to detect the contents of MDA， SOD and GSH-Px.The right kidney was sectioned and the expressions of osteopontin（0PN）and transforming growth factor-beta（TGF-beta）were detected by immunohistochemistry.Results：Compared with those of the control group， the urine volume of the study group one day after the establishment of the model decreased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group one day after the establishment of the mode were increased（P<0.05）.Compared with those of the same group before modeling， the urine volume of the study group 1 day after modeling decreased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group 1 day after modeling increased（P<0.05）.Compared with those of the same group one day after model was established， the urine volume of the study group 28 days after modeling increased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group 28 days after modeling decreased（P<0.05）.Compared with those of the control group， the content of MDA and the positive expression rate of 0PN and TGF-beta in renal tissue of the study group increased， while the content of SOD and GSH-Px of the study group decreased（P<0.05）.Conclusion：Compound Herba Desmodii Mixture can improve renal function in rats with calcium oxalate calculi， and improvement of oxidative stress and inflammation may be its mechanism.

Keywords Compound Herba Desmodii Mixture; Kidney stone; Calcium oxalate; Rat; Renal function; Oxidative stress; Inflammation

中圖分類號：R289.5;R695文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.03.019

腎結石為臨床常見多發病，其中腎草酸鈣結石為其常見類型，不但可給患者帶來較大痛楚，且可影響其腎功能[1-2]。對腎草酸鈣結石進行治療十分重要。尋找有效抑制結石形成的藥物或抑制結石沉積于腎的藥物并揭示其機制為目前研究熱點之一。近年來，中藥在腎結石中的應用較多，其中廣金錢草在腎結石中的應用已得到研究認可[3-5]。本研究亦關注了復方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能的效果，并通過其腎臟氧化應激和炎性反應變化分析藥物可能作用機制，旨在為腎草酸鈣結石治療中復方廣金錢草合劑的應用提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠40只，均由廣東省醫學實驗動物中心提供，體質量180～230 g，均采用正常顆粒飼料進行喂養，自由攝食飲水。所有大鼠購置后均適應性飼養1周后方入組進行實驗研究。

1.1.2 藥物 復方廣金錢草合劑。

1.1.3 試劑與儀器 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、骨橋蛋白（OPN）和轉化生長因子-β（TGF-β）等相關試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司。采用lympus Aul000自動分析儀，相關試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司，具體檢測操作嚴格按照儀器及相關試劑盒說明書指導進行。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SPF級雄性SD大鼠40只隨機分為觀察組和對照組，每組20只。觀察組采用2.5 kg/kg體質量的0.25%L-羥脯氨酸連續腹腔注射7 d誘導創立腎草酸鈣結石大鼠模型。

1.2.2 給藥方法 觀察組采用中山市人民醫院制劑室生產的復方廣金錢草合劑（金錢草60 g、海金沙15 g、郁金10 g、雞內金10 g、車前子10 g、瞿麥15 g、黨參15 g、黃芪15 g、菟絲子10 g、山藥15 g、木通10 g、滑石25 g、澤瀉10 g、甘草5 g，科室自制，批號：20181005）以涼開水沖泡為10 mL混懸液灌胃連續干預28 d。

1.2.3 檢測指標與方法 對照組入組后和觀察組建模前、建模后1 d、建模后28 d收集尿液標本，進行尿量、尿蛋白、尿肌酐、尿鈣等腎功能相關指標的檢測。并在收集尿液標本的同時取2組尾靜脈血2 mL，進行血肌酐、血尿素氮等腎功能指標的檢測。將獲取的尿液和血液標本以3 500 r/min轉速，3 cm半徑離心5 min，待分層后分裝于1 mL冷凍管中常規進行冷藏待測處理。觀察組干預28 d后取2組雙腎標本，其中左腎制成10%勻漿進行丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平檢測。2組大鼠右腎組織切片并通過免疫組織化學檢測骨橋蛋白（OPN）和轉化生長因子-β（TGF-β）等炎性相關蛋白表達情況，將獲得的標本常規進行石蠟包埋，制成4 μm連續切片，常規進行免疫組織化學染色觀察，相關試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司。每個樣本均隨機選取5個高倍視野（×400）進行觀察，以出現黃色或棕黃色染色為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗，計量資料均符合正態分布并采用均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本均數進行組間t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者腎功能比較

與對照組比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與本組建模前比較，觀察組建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與同組建模后1 d比較，觀察組建模后28 d尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 2組患者氧化應激指標比較

與對照組比較，觀察組腎組織MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平則降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 2組患者OPN、TGF-β比較

與對照組比較，觀察組腎組織OPN、TGF-β陽性表達率升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 2組患者腎組織OPN和TGF-β免疫組織化學染色比較 見圖1、2。

3 討論

尿石癥是一種常見的威脅人類健康疾病，其中約70%為草酸鈣結石[6-7]。腎草酸鈣結石患者的草酸鈣結晶在腎小管上皮細胞中黏附形成結石顆粒，可給患者帶來較大困擾，且其造成的腎小管上皮損傷可進一步導致腎功能損傷，嚴重威脅患者健康[8-10]。因此，對腎草酸鈣結石進行及時有效的防治十分重要。大鼠腎草酸鈣結石模型在鼠腎草酸鈣結石發病機制及其干預研究中的應用較多，可通過實驗方法確定可能有效藥物及其機制[11-13]。本研究亦采用采用L-羥脯氨酸注射法誘導創立腎草酸鈣結石大鼠模型并進行相關研究，研究中發現腎草酸鈣結石大鼠尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平升高，提示腎草酸鈣結石可對腎功能造成較為明顯的影響。

近年來結石治療取得了較大進展。以往結石的治療以西醫治療為主，最為常見的臨床治療方法為手術治療，患者經體外沖擊波碎石常可出現多種后遺癥，而一般的保守西藥治療效果欠佳，常可存在結石殘留，且臨床復發極為常見[14-15]。改善結石治療方法是目前急需解決的難題。中醫藥在臨床的應用近年來不斷增加，已有研究表明廣金錢草在結石干預中效果良好，廣金錢草中黃酮、生物堿、酚類、鞣質、多糖、皂苷、有機酸等化學成分，尤其是其中的黃酮，酮類化合物在腎結石治療中的效果已得到研究認可[16-17]。本研究亦探討復方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能的效果及其機制，結果發現，復方廣金錢草合劑干預28 d后腎草酸鈣結石大鼠的尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿鈣、血肌酐、血尿素氮水平降低，證實了復方廣金錢草合劑干預腎草酸鈣結石的良好效果，這與劉天竹等[18]研究中廣金錢草干預結石效果良好的結論一致。而本研究中腎草酸鈣結石大鼠腎組織MDA水平以及OPN、TGF-β陽性表達率均升高，SOD、GSH-Px水平則降低，提示氧化應激和炎性反應可能在腎草酸鈣結石形成中具有重要作用，而其中腎臟指標改善效果良好大鼠的氧化應激和炎性反應均較輕，提示改善氧化應激和炎性反應可能為復方廣金錢草合劑改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能的機制。

綜上所述，復方廣金錢草合劑可改善腎草酸鈣結石大鼠腎功能，而氧化應激和炎性反應干預可能為其作用主要途徑。

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（2019-03-07收稿 責任編輯：楊覺雄）