黃芪多糖對脾虛濕困大鼠內分泌、免疫相關因子的影響

趙文曉 季旭明 王媛

摘要 目的：研究黃芪多糖對脾虛濕困大鼠內分泌、免疫相關因子的影響，探討黃芪多糖健脾祛濕機制。方法：高脂低蛋白飲食加力竭游泳法建立脾虛濕困大鼠模型。黃芪多糖干預后觀察脾虛濕困大鼠體質量變化，檢測血清總蛋白（TP）、球蛋白（GLB）含量變化，ELISA法檢測血清垂體腺苷酸環化酶活化肽（PACAP）含量，免疫組化法檢測十二指腸組織IL-6、IL-10表達。結果：與模型組比較，黃芪多糖高劑量組大鼠體質量增加（P<0.05）;黃芪多糖中、高劑量組血清TP含量升高（P<0.05）;黃芪多糖低、中、高劑量組GLB水平出現升高（P<0.01），血清PACAP水平降低（P<0.01），十二指腸組織IL-6及IL-10陽性面積百分比降低（P<0.01，P<0.05）。結論：黃芪多糖可調節脾虛濕困大鼠內分泌、免疫系統相關因子進而發揮健脾祛濕功效。

關鍵詞 黃芪多糖;脾虛濕困;健脾祛濕;內分泌免疫;血清蛋白;垂體腺苷酸環化酶激活肽，白細胞介素-6;白細胞介素-10

Abstract Objective：To study effects of astragalus polysaccharides（APS）on endocrine and immune-related factors in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency， and to explore the mechanism of APS in invigorating spleen for eliminating dampness.Methods：Rat model with dampness stagnancy due to spleen deficiency was established by the high fat and low protein diet and exhaustive swimming method.After APS intervention， the change in body weight was observed， changes in serum levels of total protein（TP）and globulin（GLB）were determined， the content of pituitary adenylate cyclase activating peptide（PACAP）was determined by the ELISA method， and expressions of IL-6 and IL-10 in the duodenum were measured by an immunohistochemical method.Results：Compared with model group， the rats′ body weights in high dose APS group were increased（P<0.05）; the serum TP levels in medium and high dose APS groups were increased（P<0.05）; the GLB levels in the low， medium and high dose APS groups were increased（P<0.01）， the serum PACAP levels were decreased（P<0.01）， and positive area percentages of IL-6 and IL-10 in the duodenum were decreased（P<0.01， P<0.05）.Conclusion：APS can regulate endocrine and immune-related factors in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency to exert the effects of invigorating spleen for eliminating dampness.

Keywords Astragalus polysaccharides; Dampness stagnancy due to spleen deficiency; Invigorating spleen for eliminating dampness; Endocrine and immune; Serum protein; Pituitary adenylate cyclase activating peptide; Interleukin-6; Interleukin-10

中圖分類號：R242文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.03.018

黃芪是豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪干燥根，性溫味甘，歸脾、肺經，具有補氣升陽、益衛固表、利水消腫等功效[1-2]。黃芪多糖是黃芪主要活性成分之一，可以調節免疫、抗炎、抗氧化，在防治糖尿病、腫瘤、神經性疾病等方面具有一定作用[3-4]。我們前期研究發現黃芪及其拆分組分可改善脾虛濕困大鼠一般狀況，黃芪多糖效果最好[5]。本實驗將從內分泌、免疫調節角度，探討黃芪多糖改善脾虛濕困的機制，為脾虛濕困的機制研究及黃芪多糖臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級Wistar大鼠，48只，雌雄各半，4周齡，體質量100～120 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2014-0004。大鼠在IVC獨立送回風凈化籠中飼養。

1.1.2 藥物 黃芪生藥材購自山東濟南中魯醫院中藥房，經山東中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定為黃芪干燥根。參苓白術散（No.20140704）產自山西華康藥業有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 PACAP試劑盒（No.CK-E95360R）購自上海創祥生物科技有限公司，IL-6（No.GB11117）、IL-10兔多克隆抗體（No.GB13108）購自武漢Servicebio生物;RT-2100型多功能全自動酶標儀（深圳雷杜公司）。

1.2 方法

1.2.1 黃芪多糖制備 2.49 kg黃芪加10倍量水煎煮2次，濃縮，加95%乙醇至含醇量為80%，下層多糖溶解后，過濾上層液，再次醇沉，冷藏過夜。取下層多糖，放-80 ℃凍存，凍干機凍干。經硫酸蒽酮法檢測其含量為56.29%。

1.2.2 分組與模型制備 4周齡大鼠適應性飼養3 d后，隨機分為模型組和空白組，模型組大鼠按照文獻方法[5]，每日給與高脂低蛋白飼料與力竭游泳的方法復制脾虛濕困大鼠模型，連續誘導8周。模型復制成功后，模型大鼠隨機分為模型組、參苓白術散組、黃芪多糖低、中、高劑量組。第9周起，

1.2.3 給藥方法 按成人臨床劑量換算大鼠等效劑量，參苓白術散為2.5 g/kg，黃芪多糖分別為300、600、1 200 mg/（kg·d），1次/d，1 mL/100 g，連續灌胃2周。每天下午觀察大鼠一般狀況，記錄體質量變化。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 血清TP、GLB 大鼠麻醉后，腹腔靜脈取血，室溫靜置后，3 000 r/min離心10 min，獲得血清，使用全自動生化分析儀進行TP、GLB檢測。

1.2.4.2 血清PACAP 血清PACAP含量嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.4.3 十二指腸組織IL-6、IL-10 大鼠麻醉后迅速剪取十二指腸組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，3 μm組織切片脫蠟后，加入一抗，4 ℃孵育過夜，沖洗后加入二抗，室溫孵育50 min，PBS沖洗，加入二氨基苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，脫水，封片。采用Image J軟件對陽性染色區進行陽性面積百分比（%Area）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪多糖對體質量影響

第1周模型復制前各組大鼠體質量差異無統計學意義。第8周模型復制結束時與空白組比較，造模后模型大鼠體質量顯著下降（P<0.01）。第10周給藥后與模型組比較，黃芪多糖高劑量組和參苓白術散組大鼠體質量顯著升高（P<0.01）。見表1。

2.2 黃芪多糖對血清TP、GLB水平的影響

與空白組比較，模型組血清TP及GLB水平下降（P<0.05）。與模型組比較，黃芪多糖中劑量組、高劑量組血清TP水平升高（P<0.05），黃芪多糖低、中、高劑量組血清GLB水平顯著增加（P<0.01），參苓白術散組GLB水平升高（P<0.05）。見表2。

2.3 黃芪多糖對血清PACAP水平的影響

與空白組比較，模型組血清PACAP水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，黃芪多糖低、中、高劑量組血清PACAP水平顯著降低（P<0.01）。參苓白術散組PACAP水平顯著降低（P<0.01）。見表3。

2.4 黃芪多糖對十二指腸組織IL-6、IL-10的影響

與空白組比較，模型組大鼠十二指腸組織IL-6和IL-10陽性面積百分比顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，黃芪多糖低、中、高劑量組IL-6表達均出現降低（P<0.01），IL-10表達也出現不同程度的降低（P<0.05，P<0.01），參苓白術散組IL-6、IL-10表達降低（P<0.05，P<0.01）。見表4。

3 討論

中醫理論中脾為后天之本，氣血生化之源，是以消化系統為主的多系統、多功能綜合單位，其功能與消化、血液、內分泌、免疫系統密切相關。若脾失健運，則會引起出現水谷精微運化障礙，表現為消瘦、氣血衰少、倦怠、眩暈、水腫等脾虛濕困癥狀。研究發現，脾氣虛證患者內分泌免疫網絡相關神經遞質、胃腸激素、免疫球蛋白等出現異常[6]。遞質、激素及細胞因子等相互聯系的遞質構成復雜網絡調節機體內環境穩定[7]。脾臟通過胃腸道內分泌、免疫網絡間相關因子的作用發揮運化、統血等功能。胃腸道存在大量神經元、內分泌及免疫細胞，成為內分泌、免疫調節網絡的重要部位。因此，本研究以胃腸道內分泌、免疫系統中相關因子變化為切入點，使用本課題組依據飲食失節、勞倦傷脾中醫理論建立的脾虛濕困動物模型，研究黃芪多糖健脾祛濕的作用機制。

黃芪是一味補氣扶正要藥?！吨腥A人民共和國藥典》明列黃芪具有“扶正固本、補中益氣”的功效。據報道黃芪對內分泌、免疫系統均有廣泛的作用[8]。黃芪多糖使其主要活性物質之一，對內分泌、免疫系統同樣具有廣泛作用。本實驗結果顯示，黃芪多糖可增加體質量及血清蛋白水平，我們推測黃芪多糖通過脾虛濕困大鼠的內分泌、免疫網絡從而增加體質量，增強免疫功能等，發揮健脾祛濕功效。

本實驗結果顯示，脾虛濕困大鼠血清PACAP顯著升高。PACAP是一種具有廣泛活性的內分泌多肽，主要分布于中樞神經系統、消化系統、內分泌系統等神經纖維中，是神經-內分泌-免疫系統共同的化學信號分子之一，可通過腸道神經系統調節水鹽吸收和分泌，降低攝食量、胃酸分泌等[14-15]。此外，還在免疫和抗炎中發揮重要作用。PACAP38可以刺激元代培養的大鼠垂體前葉細胞釋放IL-6，同時還可以增加IL-10基因表達[16]。因此，本實驗結果模型大鼠PACAP水平升高提示機體內分泌及免疫系統失調，食物消化、水液代謝及免疫等代謝異常，黃芪多糖通過降低PACAP水平從而改善脾虛濕困時機體消化吸收、水液潴留、免疫低下等狀況。

我們還發現，脾虛濕困大鼠十二指腸組織IL-6和IL-10水平升高。IL-6主要由單核巨噬細胞、淋巴樣細胞等產生，是一種多效應細胞因子，在免疫應答、造血調節、內分泌系統中發揮重要作用，還可減少白蛋白、轉鐵蛋白等多種蛋白表達，控制B細胞，調節IL-10分泌等[9]。正常機體血清IL-6濃度相對較低，當疾病發生時IL-6濃度急速升高。IL-10是多細胞分泌的多效價細胞因子，免疫細胞和中樞神經細胞均可分泌。研究發現，脾虛患者IL-6水平及基因表達增加，脾虛大鼠腦內IL-6受體、IL-10水平及基因表達增加[10-13]，與本實驗結果相一致。因此本實驗結果提示，黃芪多糖通過調節脾虛濕困大鼠IL-6、IL-10水平，進而增強機體免疫，調節內分泌等系統，以改善脾虛濕困癥狀。

總之，黃芪多糖可通過調節內分泌、免疫網絡中PACAP、IL-6、IL-10水平，進而增加體質量，促進消化吸收，增強機體免疫，調控機體內環境穩定，從而改善機體脾虛濕困狀態，發揮健脾祛濕的功效。

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（2018-11-03收稿 責任編輯：徐穎）